血漿組蛋白H4與膿毒癥患者嚴重程度及預后關系研究

郭 菲，王力軍，么 穎，劉艷存，曹 超，王紫怡，柴艷芬

（天津醫科大學總醫院急診醫學科，天津300052）

膿毒癥是危重癥病人常見死亡原因，其發病率不斷上升，且花費巨大，已成為全球范圍的主要公共健康問題[1-3]。分子標志物是膿毒癥研究熱點，一些標志物在診斷膿毒癥方面取得一定進展，但臨床尚缺乏評估患者嚴重程度和預后的良好指標。

組蛋白是染色體的基本結構蛋白，共有5種類型：H1/H5、H2A、H2B、H3、H4，因 H3 和 H4 毒性最強[4]，目前研究也最廣泛。2008年，Xu等首次報道胞外組蛋白是膿毒癥小鼠模型的主要致死因素，其毒性作用導致膿毒癥小鼠內皮細胞損傷、器官功能衰竭甚至死亡，H4抗體能降低小鼠病死率[5]。Wildhagen等發現血漿組蛋白H3與膿毒癥患者病死率和危重病評分相關，可作為膿毒癥預后的預測指標[6]。關于血漿組蛋白H4的臨床研究相對較少[7]。

細胞凋亡或壞死時染色質降解，核內組蛋白被釋放至細胞外，稱為細胞外組蛋白（Extracellular histone,EH）。EH進入血液循環稱為循環組蛋白或血漿組蛋白[8]。膿毒癥新近研究顯示細胞凋亡在膿毒癥及膿毒癥心肌抑制的發生發展過程中發揮重要作用[9]。膿毒癥死亡患者發生明顯細胞凋亡[10]。Caspase-3是細胞凋亡過程的主要執行分子，本研究探討膿毒癥患者血漿組蛋白H4濃度變化和凋亡的關系，血漿組蛋白H4濃度是否與膿毒癥患者嚴重程度有關以及是否可作為判斷膿毒癥預后的指標。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2017年5月-2018年4月天津醫科大學總醫院急診醫學科收治的50例膿毒癥患者。病例納入標準：入院24 h內符合sepsis 3.0標準的患者，即機體對感染的反應失調而導致危及生命的器官功能障礙（感染+ΔSOFA評分≥2）。病例分組標準：根據患者28日生存情況，將其分為存活組和死亡組。所有患者（家屬）均告知此研究的目的、研究程序以及參加此研究不影響患者的治療方案，均簽署知情同意書。本研究經天津醫科大學總醫院倫理委員會審核通過（IRB2018-152-01）。排除標準：（1）年齡＞80 歲或＜18 歲；（2）腫瘤患者；（3）失代償性肝硬化；（4）急性壞死性胰腺炎；（5）慢性終末期腎病患者；（6）孕婦；（7）免疫性疾病活動期；（8）不能完成該試驗者。

1.2 血漿組蛋白H4和caspase-3檢測方法 膿毒癥患者入院24 h和72 h時，采集靜脈血5 mL置檸檬酸鈉抗凝采血管中,-4℃冰箱內保存10～20 min，隨后3 000 r/min離心10 min。收集血漿，-80℃冰箱保存。采用上海廣銳生物科技有限公司提供的EH4（產品批號 20171226）和 caspase-3（產品批號20171223）檢測試劑，用酶聯免疫分析法集中檢測血漿組蛋白H4和caspase-3濃度。

1.3 其他資料收集 收集患者入院24 h及72 h的白細胞計數（white blood cell,WBC）、中性粒細胞絕對值及其比例（absolute neutrophil cell，ANC，N%）、血小板計數（platelet,PLT）、血清降鈣素原（procalcitonin,PCT）、C-反 應 蛋 白 （C-reactive protein,CRP）、乳酸（lactic acid,LAC）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）等生化指標。LAC用GEM Premier 3000血氣分析儀床旁及時測定，PCT用Pylon 3d循環增強熒光分析儀床旁即時測定，其他指標由我院檢驗中心測定。計算患者24 h和72 h疾病嚴重程度（APACHEⅡ評分、SOFA評分），并記錄患者28日生存情況。

1.4 統計學方法 應用SPSS 24.0軟件進行統計分析，符合正態分布的定量資料以±s表示，兩組比較采用LSD-t檢驗；非正態分布的計量資料以中位數（四分位數）[M（Q1,Q3）]表示，兩組比較采用 Mann-Whitney U檢驗。定性資料（28 d時存活狀態）采用χ2檢驗，兩變量相關性采用Spearman相關分析。繪制ROC曲線，根據約登指數找出最佳截斷點，并計算各指標曲線下面積、敏感性及特異性。以P＜0.05為有統計學差異。72 h血漿組蛋白H4清除率=（72 h血漿組蛋白H4濃度-24 h血漿組蛋白濃度）/24 h血漿組蛋白H4濃度×100%。

2 結果

2.1 一般資料比較 50例膿毒癥患者中存活40例，死亡10例。存活組男25例，女15例，年齡（65.6±15.79）歲；死亡組 男 9例，女 1例，年齡（64.92±16.44）歲。兩組患者的一般資料和入院24 h臨床指標等數據比較，見表1。兩組患者24 h和72 h血漿組蛋白H4濃度比較，見表2。

表1 兩組患者一般資料和入院24 h觀察指標比較Tab 1 Comparision of clinical data and clinical parameters at 24 h

表2 膿毒癥患者存活組與死亡組24 h和72 h血漿組蛋白H4濃度比較Tab 2 The comparision of plasma histone H4 levels at 24 h and 72 h in survivors and non-survivors of septic patients

2.2 血漿組蛋白H4與觀察指標間的相關性分析 以 WBC、ANC、PLT、PCT、CRP、LAC、LDH 和Caspase-3作為觀察指標，上述指標與血漿組蛋白H4相關性分析見表3。結果提示24 h和72 h血漿組蛋白 H4與 PCT、CRP、caspase-3呈正相關，72 h血漿組蛋白H4與LDH呈正相關，24 h和72 h血漿組蛋白H4與PLT呈負相關，見表3。

表3 血漿組蛋白H4濃度與觀察指標的相關性分析Tab 3 The correlation between plasma histone H4 and observation parameters

2.3 血漿組蛋白H4與疾病嚴重程度的相關性分析 24 h時血漿組蛋白H4濃度與APACHEⅡ評分和SOFA評分均呈顯著正相關（r值分別為0.747，和 0.631，P 均＜0.05）。72 h 時血漿組蛋白 H4濃度與APACHEⅡ評分無顯著相關性，72 h時血漿組蛋白H4濃度與SOFA評分呈正相關，見表4、圖1。

表4 兩時間點血漿組蛋白H4濃度與疾病嚴重程度的相關性分析Tab 4 The correlation between plasma histone H4 levels and the disease severity at 24 h and 72 h

圖1 24h血漿組蛋白H4與APACHEⅡ評分和SOFA評分相關性Fig 1 The correlation of plasma histone H4 levels with APACHEⅡscore and SOFA score

2.4 血漿組蛋白H4與膿毒癥預后的相關性 膿毒癥患者死亡組血漿組蛋白H4濃度高于存活組，24 h 差異有統計學意義[505.80（462.46，657.85）vs 408.09（370.68，483.31），P＜0.05]（圖2）；72 h差異無統 計 學 意 義 [429.95 （354.12，557.70）vs 357.70（331.33，391.16），P＞0.05]。存活組 72 h 血漿組蛋白H4濃度低于24h血漿組蛋白H4濃度，差異有統計學意義[357.70（331.33，391.16）vs408.09（370.68,483.31），P＜0.05]。死亡組72h血漿組蛋白H4濃度與24 h血漿組蛋白H4濃度差異無統計學意義[429.95（354.12,557.70）vs505.80（462.46,657.85），P＞0.05]。計算72 h血漿組蛋白H4清除率+100%，存活組與死亡組差異無統計學意義 [111.1%（99.53%，131.08% vs 100%（100%，100%），P＞0.05]。

兩組間 24 h 觀察指標中，Caspase-3、PCT、CRP、PLT、APACHEⅡ評分和SOFA評分有統計學差異，72 h觀察指標均無統計學差異。以24 h血漿組蛋白 H4、Caspase-3、PCT、CRP、PLT、APACHE Ⅱ評分和SOFA評分來判斷膿毒癥患者預后，繪制ROC曲線（圖3），并計算曲線下面積。24 h血漿組蛋白H4的AUC為0.804，高于其他指標，cutoff值452.66，敏感度 0.889，特異性 0.684（表 5）。

圖2 膿毒癥患者存活組和死亡組24 h血漿組蛋白H4濃度比較Fig 2 The comparision of plasma histone H4 levels at 24 h between survivors and non-survivors of septic patients

圖3 血漿組蛋白H4、Caspase-3、APACHEⅡ評分和SOFA評分判斷膿毒癥患者預后的ROC曲線圖Fig 3 TheareaundertheROCcurveofplasmahistoneH4,Caspase-3,APACHEⅡscore and SOFA score as prognostic markers

表5 血漿組蛋白 H4、Caspase-3、PCT、CRP、PLT、APACHE Ⅱ評分和SOFA對膿毒癥患者預后的診斷價值Tab 5 The prognostic value of plasma histone H4,Caspase-3,PCT,CRP,PLT,APACHEⅡ score and SOFA score in septic patients

3 討論

中國嚴重膿毒癥/膿毒性休克治療指南（2014）提出血清乳酸水平可作為患者病情嚴重程度的標志。但是單純監測血清乳酸水平不能準確反映組織氧供、氧耗的動態變化。雖然乳酸清除率可糾正單一時間點監測的缺陷，但需時間長且操作繁瑣，不利于早期評估患者病情嚴重程度。膿毒癥發病機制復雜，炎癥反應失衡、免疫功能紊亂、微循環功能障礙、凝血障礙、線粒體損傷、內質網應激、細胞凋亡與自噬、基因多態性及神經-內分泌-免疫網絡等均參與膿毒癥的發生和發展[11-12]。

EH與膿毒癥炎癥反應、免疫癱瘓和凝血障礙等機制密切相關[7]，EH作為細胞毒性損傷相關分子模式蛋白，通過激活Toll樣受體、促進炎癥反應和改變磷脂膜通透性等多種機制，誘導肺、心臟、肝、腎及脾損傷，出現多器官功能障礙綜合征[13-14]。此外，膿毒癥時炎癥反應、微血管內血栓形成和內皮細胞功能失調等致全身靶器官損傷及大量炎癥細胞壞死，核內組蛋白大量溢出至細胞外，再次誘導炎癥因子激活或釋放，從而形成惡性循環[15-16]。另有學者發現中性粒細胞胞外誘捕網也是血漿組蛋白的重要來源[17-18]。

本研究發現，膿毒癥患者入院24 h血漿組蛋白H4濃度與APACHEⅡ評分和SOFA評分有較好的正相關性（r值分別為 0.747 和 0.631，P＜0.05），24 h血漿組蛋白H4濃度可反應膿毒癥患者嚴重程度。APACHEⅡ評分和SOFA評分是臨床常用的病情嚴重程度評分系統，評分越高患者病情越重。APACHEⅡ評分[19]能夠較好的預測膿毒癥患者預后，因其較高的敏感性和特異性，目前應用最為廣泛。但需要指標較多，計算過程繁瑣。qSOFA評分被推薦為急診床旁篩查膿毒癥和評估預后的工具[2]，但Park等[20]研究表明其敏感性較低，有漏診風險。Raith等研究表明qSOFA評分對危重的感染患者的預后評估價值有限[21]。膿毒癥時，患者血漿組蛋白H4升高時間早，與APACHEⅡ評分和SOFA評分有較好的相關性，敏感性、特異性較高，可早期、準確評估膿毒癥患者嚴重程度。

本研究中，死亡組患者入院24 h血漿組蛋白H4濃度高于存活組。此與Ekaney等研究結果一致[5,22-23]。動態監測膿毒癥患者血漿組蛋白H4濃度變化，存活組患者72 h血漿組蛋白H4濃度較24 h明顯下降。可能與膿毒癥存活組患者細胞損傷較前減輕，組蛋白來源減少而機體清除能力增強有關。說明血漿組蛋白H4濃度下降預測患者病情好轉。既往關于膿毒癥血漿組蛋白H4動態變化的研究很少，Ekaney等[22]報道ICU膿毒癥患者入院第3天血漿組蛋白H4濃度較第1天顯著下降，患者第1天的血漿組蛋白H4濃度與病死率有關。本研究結果與其一致。本研究死亡組患者兩時間點血漿組蛋白H4濃度無統計學差異，可能與膿毒癥死亡患者清除組蛋白能力嚴重受損有關，也可能與樣本量小有關。死亡組與存活組72 h血漿組蛋白H4清除率沒有統計學差異，考慮與死亡組72 h樣本量小有關。有待多中心、大樣本量的研究證實膿毒癥死亡患者的血漿組蛋白H4變化情況。

臨床常用指標如 PCT、CRP、LAC、WBC、ANC 和PLT等均對評估膿毒癥嚴重程度和預后有一定作用[24-26]，但是這些指標的臨床價值尚存爭議。本研究中，臨床常用指標 PCT、CRP、PLT、APACHE Ⅱ評分和SOFA評分在預測膿毒癥患者預后方面有診斷價值，此與Sadaka等學者結論一致[22-24]。用ROC曲線下面積評估各指標對膿毒癥患者預后的價值，24 h血漿組蛋白H4的AUC為0.793，高于PCT、CRP、PLT、Caspase-3、APACHEⅡ評分和SOFA評分。此外，血漿組蛋與PCT、CRP和APACHEⅡ評分和SOFA評分呈正相關，而與PLT計數呈負相關。表明血漿組蛋白H4是較好的膿毒癥患者預后的指標。

膿毒癥細胞凋亡與胞外組蛋白H4密切相關。細胞凋亡途徑主要包括內源性途徑和外源性途徑[27]，Caspase、Fas/FasL、Bcl-2、Livin 等均可作為反映細胞凋亡的標志物，其中Caspase家族在膿毒癥細胞凋亡的發生發展過程中發揮關鍵作用[28]。細胞凋亡的兩種途徑都作用于caspase-3。Caspase-3在凋亡早期階段即可被激活，活化后裂解相應的胞漿胞核底物，引發細胞凋亡，影響組織器官功能，甚至危及生命[9]。本研究發現，血漿caspase-3在膿毒癥患者24 h和72 h時均明顯升高，存活組患者72 h血漿caspase-3濃度較24 h明顯下降。血漿組蛋白H4在膿毒癥患者24 h和72 h時均與caspase-3呈正相關（P均＜0.05）。該結果與凋亡是組蛋白來源之一相吻合，細胞凋亡增加導致血漿組蛋白H4濃度升高，推測細胞凋亡是血漿組蛋白H4導致膿毒癥患者病死的機制之一。細胞凋亡與膿毒癥患者不良預后有關。Lorente等報道caspase-3濃度與膿毒癥患者早期病死率相關[29]，本研究結果與其一致。Santiago等學者發現血漿組蛋白通過mTOR途徑，以劑量依賴性的方式，激活內皮細胞的凋亡和自噬，從而導致膿毒癥和膿毒性休克的發生[30]。

膿毒癥患者常并發凝血系統功能紊亂[31]，此過程與血漿組蛋白H4有關。本研究中，血漿組蛋白H4與血小板計數呈顯著負相關。EH通過血小板活化和血栓栓塞等多種機制，誘導凝血功能紊亂[32]。所有組蛋白亞型均可促進血小板的聚集和血栓形成。然而，H4亞型的上述作用最強[33]。此作用與TLR2及TLR4有關，也可能有其他機制[32]。

本研究還納入LDH做為觀察指標，在體外試驗中LDH濃度與細胞膜損傷程度相關。胞外組蛋白對內皮細胞有直接毒性，血漿組蛋白H4可通過直接細胞毒性參與膿毒癥病情進展[20]。本研究中，血漿組蛋白H4與LDH呈正相關，此與既往研究結果一致[20]。

本研究存在一定的局限性。首先，Alhamdi等[34]發現，胞外組蛋白在膿毒癥患者出現時間為發病10 h，達峰時間為16～24 h。本研究未監測膿毒癥患者24 h內的血漿組蛋白及caspase-3濃度，另外，本研究選取的時間點為膿毒癥患者入院24 h及72 h，但患者入院前可能已符合膿毒癥標準，導致數據不能真實反映膿毒癥兩時間點的狀態。其次，在膿毒癥發病機制中存在促炎（如IL-1、IL-6和TNFα）與抗炎（如IL-2、IL-10和IFN-γ）的動態變化過程。本研究沒有監測以上炎性因子，而選擇WBC、PLT、PCT、CRP、LAC和LDH等，不能說明血漿組蛋白H4在膿毒癥早期對炎性因子的影響。再次，細胞凋亡的標志物有促進凋亡與抑制凋亡之分，本研究僅選取了促進凋亡的caspase-3，不能充分闡釋膿毒癥細胞凋亡和組蛋白的關系。膿毒癥時導致血漿組蛋白H4升高的凋亡細胞類型尚不明確，有待進一步證實。總之，膿毒癥病人入院24 h時血漿組蛋白H4濃度可反應疾病嚴重程度，并作為判斷預后的預測指標。胞外組蛋白不僅是新型生物標記物，也是未來治療靶點。中和循環中組蛋白、使用EH抗體及阻斷組蛋白信號轉導等措施，可能為治療膿毒癥提供新方向。