小鼠小腸不同部位細胞中的胰島素分泌水平

周翰馳，陳皓，張瑞，郭剛

（天津醫科大學代謝病醫院內分泌研究所，衛生部激素與發育重點實驗室，天津300070）

II型糖尿病是世界范圍內的主要公共衛生問題。對370個國家的270萬人進行的多國健康調查分析表明，從1980-2008年，全世界II型糖尿病的患病率翻了一番[1-2]。這種趨勢將持續到2025年，并給每個國家的醫療保健系統帶來沉重的財政負擔[3-4]。其病理生理學不僅涉及胰腺，還涉及到肝臟、骨骼肌、脂肪組織、胃腸道、腦和腎臟[5]。國際糖尿病聯合會的報告指出，到2040年，預計全球將有超過6 000萬人患有糖尿病。2007年，美國用于診斷和治療糖尿病的花費達到1 740億美元[6]。

以往的觀點認為，胰島素由胰腺分泌，胰腺中主要的分泌細胞有α細胞和β細胞兩種，前者主要分泌胰高血糖素，后者主要分泌胰島素。近年來隨著研究的進一步深入，人們發現在2型糖尿病的致病因素中，β細胞去分化也占有一定的比例，并且在一定情況下去分化的β細胞會分化為α細胞，進一步的破壞血糖平衡[7]；在這一過程中，PDX1扮演著重要的角色。胰腺十二指腸同源框-1蛋白（PDX1）是存在于胰腺β細胞中的含282個氨基酸的同源結構域轉錄因子。PDX-1是β細胞中胰島發育和胰島素基因轉錄的關鍵調節劑，可以加強β細胞活性，減少β細胞凋亡，并且防止其去分化。PDX-1在發育早期的所有細胞中均有表達，成年后主要限于胰腺和十二指腸。此外，還有研究指出經PDX-1處理的小腸上皮細胞（IEC-6）可以分化成為合成胰島素的細胞[8]。

有諸多研究表明胰腺外存在胰島素或胰島素類似物。有文章指出，通過RT-PCR和免疫組化實驗，在胎鼠和乳鼠的大腦、肝臟、視網膜等組織中發現了前胰島素原和胰島素類似物[9]。中樞神經系統中，也已經有研究證實下丘腦有胰島素分泌[10]。在STZ小鼠肝臟、脂肪、骨髓等組織中也發現了胰島素mRNA[11]。

在胚胎發育階段，胰島內分泌細胞和小腸上皮細胞有著共同的起源，這意味著小腸中可能有某些細胞具有分泌胰島素的潛能。小腸可以分泌包括胰高血糖素在內的多種胰肽，但是一直以來少有證據能夠證明小腸可以合成胰島素。在我們的前期研究中發現，小腸含有胰腺細胞特異性的識別蛋白，該蛋白質為胰島細胞抗原512（ICA512）。ICA512是一種受體型PTP樣蛋白，含有跨膜區，細胞內PTP樣結構域和一個胞外N端，定位于分泌顆粒，ICA-512僅在胰島細胞中表達并且參與調節分泌顆粒的胞吐作用。本研究選用未經處理的C57BL/6J小鼠，針對小腸不同部位，從基因和蛋白等水平來證明有胰島素在小腸的細胞中合成。

1 材料與方法

1.1 動物材料 所有的實驗用小鼠均購自北京華寶生物科技有限公司。小鼠在無特殊病原菌的動物房喂養，室溫為恒溫23℃。適應1周后，選取健康的雄性C57BL/6J小鼠（n=5）通過腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，然后處死，剪取十二指腸、空腸、回腸、胰腺。所有動物實驗得到動物倫理和實驗部門的批準，且按照天津醫科大學委員會的要求進行。

1.2 免疫熒光檢測 將動物組織用石蠟包埋，制成切片，二甲苯脫蠟，100%～70%濃度梯度乙醇脫水，Tris-EDTA溶液抗原修復，室溫下Tirton處理15min，經PBS漂洗后，用牛奶封閉，分別用胰島素抗體、PDX1抗體、ICA-512抗體4℃孵育過夜，PBS漂洗后，分別用FITC標記的山羊抗小鼠二抗和TRITC標記的山羊抗兔二抗孵育，室溫1 h，用DAPI將細胞核染色，封片。在熒光顯微鏡下檢測。

所用試劑如下：胰島素抗體（1:1 000,ab6995,abcam,UK），PDX1抗體（1:2 000,ab47267,abcam,UK），ICA-512抗體（1:500,sc-130570,santa cruz,USA），FITC標記的抗小鼠二抗 (1:200,ZF-0312,ZSGB,Beijing,China），TRITC 標記的抗兔二抗（1:200,ZF-0316,ZSGB,Beijing,China）。

1.3 電子掃描顯微鏡檢測 剪取一小段組織放入2.5%戊二醛固定液中，經PBS漂洗后用1%鋨酸緩沖液固定，用濃度50%～100%濃度梯度的丙酮脫水，再用spurr包埋劑進行包埋，待包埋完成后，切片在電子掃描顯微鏡下觀察。

1.4 實時定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR） 用TRIzol（9108,TaKaRa,Biotech,Japan）裂解小鼠組織，加入氯仿，4℃離心，13000r/min，取上清液，加等體積異丙醇，4℃離心，沉淀加75%乙醇，漂洗離心，13000r/min，干燥后，加入20 μL DEPC水，即為組織RNA。逆轉錄獲得 cDNA（AT301-03,TransGen Biotech,Beijing,China）。RT-PCR（AQ131-04,TransGenBiotech,Beijing,China）檢測內參β-actin以及胰島素mRNA的表達量。

胰島素引物序列：上游 5′-CTGGTGGG CATCCAGTAACC-3′，下游 5′-ACACACCAGGTAGAGAGCCT-3′，產物長度 209bp。

β-actin引物序列：上游 5′-CATTGCTGA CAGGATGCAGAAGG-3′，下游 5′-TGCTGGAAGGTGGACAGTGAGG-3′，產物長度 138bp。

擴增條件：95℃預變性1 min,然后依次為94℃變性10 s,58℃退火15 s,72℃延伸20 s,共40個循環。每次PCR反應至少重復3次。

1.5 Western印跡分析 組織用RIPA和蛋白酶抑制劑PMSF分解，按組織：RIPA：PMSF=20mg：100μL：1 μL的比例提取蛋白質，通過聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）之后，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜（Nitrocellulose Blotting Membranes,NC）上，用 5%的脫脂奶粉在室溫下封閉2 h，用胰島素抗體4℃孵育過夜，PBST漂洗后，與HRP標記的抗兔二抗結合，室溫1 h，PBST漂洗后，用ECL印跡檢測使蛋白條帶可視化，檢測其表達量。

所用試劑如下：胰島素抗體（1∶2 000，15848-1-AP,proteintech），GAPDH 抗體 （1∶5 000，AP0066，Bioworld Technology，Inc.,USA），辣根過氧化物酶抗兔二抗（1∶2 000，BS13278，Bioworld Technology，Inc.,USA），ECL 印跡檢測試劑（WBKLS0500，Millipore Corporation）。

2 結果

2.1 形態學檢測發現小腸表達胰島素 將小腸按照十二指腸、空腸、回腸分成3組，以胰腺作為陽性對照，分別檢測其胰島素及PDX1的表達。結果顯示胰島素及PDX1在部分細胞中同時存在（圖1A），十二指腸表達量略少于空腸和回腸，空腸和回腸表達量沒有顯著差異。同時筆者還發現在小腸中存在少量的 ICA-512（圖 1B）。

電子掃描顯微鏡觀察的結果顯示，在十二指腸（圖 2A），空腸（圖 2B），回腸（圖 2C）中都存在類似胰島素的分泌顆粒，表達量上并無明顯差異。

形態學的結果表明，小腸中的胰島素存在于細胞內部，眾所周知，胰島素是作用在細胞表面胰島素受體的一種蛋白質，胰島素本身在完成生理作用的過程中不會進入細胞，所以可以認為，筆者檢測到的胰島素是由小腸細胞自身合成的，并非由胰島β細胞合成再經血液轉運而來。

圖1 免疫熒光檢測小腸中的胰島素Fig 1 Immunofluorescence detection of insulin in the small intestine

圖2 電鏡檢測小腸中的胰島素分泌顆粒Fig 2 Electron microscopy of insulin secretion granules in the small intestine

2.2 RT-PCR及western檢測小腸胰島素陽性 用β-actin為內參，RT-PCR檢測十二指腸、空腸、回腸和胰腺中胰島素mRNA的相對表達量（圖3A）?？漳c與十二指腸和回腸的胰島素相對表達量的差異具有統計學意義（P＜0.05），小腸組織與胰腺之間差異更為明顯（P＜0.01）。通過Western blot對小腸中胰島素表達量的檢測得到了和RT-PCR相一致的結果（圖3B），同樣選取β-actin作為內參，圖中顯示的是胰島素在各個部位的相對表達量，其中空腸與十二指腸和回腸的表達量具有明顯差異（P＜0.05）。和RT-PCR結果一致，小腸中空腸的胰島素表達量最高，十二指腸和回腸表達量沒有顯著差別。取樣時小鼠空腹 8h，血糖水平為 7.3mol/L，8.5mol/L，5.8mol/L。

圖3 RT-PCR及WB分析小腸中胰島素mRNA和蛋白質的相對表達量Fig 3 RT-PCR and WB analysis of relative expressions of insulin mRNA and protein in the small intestine

3 討論

I型糖尿病致病原因是胰島β細胞功能損壞，II型糖尿病的病因除β細胞功能損害外還有胰島素抵抗等等。目前治療糖尿病的手段主要有口服降糖藥物、胰島素注射、胰島素泵等，無論哪種治療方法都需要長期用藥，不但對患者身心有所危害也對患者經濟條件有一定挑戰。筆者急需找到新的治療方法來解決日趨嚴峻的糖尿病防治問題。目前，胰島細胞移植療法和干細胞培育療法獲得了一定的關注，但術后的免疫排斥反應以及細胞來源的缺乏造成了很大阻礙。本研究證明小腸具有生物合成胰島素的功能，可能為未來糖尿病的防治提供一個新的思路。

長久以來，有許多研究和報道顯示，體內存在非胰腺胰島素或稱胰外胰島素。在小腸中發現了有前胰島素原和胰島素mRNA存在[9，12]。短期禁食會促使小鼠的下丘腦表達胰島素[10]。在糖尿病小鼠的肝臟、脂肪、脾臟、骨髓及胸腺中發現了胰島素原的mRNA和蛋白質[11]。筆者可以看到在糖尿病或禁食等非正常狀態下，機體很多組織都具有一定的表達胰島素的能力。而在正常的健康狀態下，僅有小腸檢測出了胰島素基因轉錄陽性。這說明在正常的身體能量代謝過程中，小腸胰島素參與了某些調控能量代謝的過程。此外，我們的前期研究發現，將8周齡Wister大鼠禁食24 h，分別灌胃50%葡萄糖溶液、牛血清白蛋白溶液、油脂懸液，結果顯示小腸部分存在動態變化的胰島素mRNA，且與胰腺表達高峰時間不同[13]。

在探索小腸是否能成為潛在的胰島素分泌的器官時，一種蛋白質GLP-1引起了極大的注意。GLP-1是一種胰高血糖素基因編碼的由回腸L細胞分泌的腸促激素，其在體內的主要活性形式為GLP-17-37和GLP-17-36，主要作用在胰島β細胞，具有防止β細胞凋亡，促進胰島素分泌等作用[14-15]。GLP-11-37在體內的作用尚不明確，但研究發現其可以誘導小腸上皮細胞分泌胰島素[16]，還可以增加小鼠的葡萄糖耐受性[17]。有團隊進一步證明，GLP-1可以誘導大鼠小腸隱窩上皮細胞（IEC-6）表達胰島素，此外，給大鼠口服可以表達GLP-11-37的工程菌制片，可以有效增加大鼠的糖耐量[18]。

小腸胰島素的作用雖然尚不明確，但我們根據現有文獻資料猜測其可能具有以下兩種功能：一是小腸胰島素的分泌受葡萄糖含量的影響，同時回腸L細胞分泌GLP-1的過程受到胰島素含量和血糖水平的調控[14-15]，小腸胰島素可以通過旁分泌或自分泌結合血糖水平來調節GLP-1的表達，進一步影響胰島β細胞生成胰島素。二是小腸胰島素可能具有調節局部血糖的作用，尤其在進食后及腸道吸收葡萄糖的過程中，通過小腸分泌的胰島素，防止由于集中吸收葡萄糖而使血糖快速上升造成危害。