FSTL1促進間歇性低氧誘導的肺成纖維細胞活化

徐雷倩，曹 潔

（天津醫(yī)科大學總醫(yī)院呼吸科，天津300052）

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（OSAS）是以睡眠過程中頻繁的呼吸暫停、血氧飽和度下降和睡眠紊亂為主要特征的臨床綜合征[1]。OSAS對機體的危害是多系統(tǒng)的，除了呼吸系統(tǒng)外，還包括心腦血管、神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)以及內(nèi)分泌系統(tǒng)等，嚴重者易出現(xiàn)夜間猝死的情況，這些并發(fā)癥與OSAS的間歇性低氧密切相關(guān)。OSAS與呼吸系統(tǒng)疾病密不可分，臨床上將兩者共患稱為重疊綜合征。肺心病是其中最為突出的一個疾病，患者往往有嚴重的肺動脈高壓和右心衰竭[2]。由于呼吸功能障礙，夜間長時間的呼吸暫停，使得急性呼吸衰竭的發(fā)生率升高，出現(xiàn)嚴重呼吸困難、發(fā)紺、抽搐等表現(xiàn)[3]。另外肺纖維化的發(fā)生發(fā)展也與OSAS相關(guān)，可能原因是間歇性低氧對肺成纖維細胞的活化作用。對于阻塞性睡眠呼吸暫停的治療以呼吸機治療為主，用于擴張氣道，減少夜間呼吸事件的發(fā)生，防止過低的通氣導致的夜間猝死和并發(fā)癥[4]。氧化應激在OSAS進程中具有十分重要的作用，它能與TGF-b、NF-kb、AMPK等多種信號通路相互聯(lián)系，共同促進疾病的發(fā)生發(fā)展。Fstl1最初是從TGF-b1誘導的小鼠成骨細胞系MC3T3中克隆得到，其編碼一個胞外分泌的小分子糖蛋白。最近的研究發(fā)現(xiàn)FSTL1在特發(fā)性肺纖維化以及矽肺等纖維化疾病中是一個新的促纖維化因子。Fstl1能夠通過增強TGF-b信號而促進肺成纖維細胞的活化，以及膠原和纖連蛋白等細胞外基質(zhì)（ECM）的沉積，最終加劇肺纖維化的發(fā)展。利用Fstl1基因敲除小鼠或者FSTL1蛋白的中和性抗體阻斷體內(nèi)FSTL1的生物學功能則能夠減緩肺纖維化的嚴重程度[5]，說明Fstl1可能是纖維化肺疾病的一個重要靶點。目前，F(xiàn)stl1與OSAS以及其并發(fā)癥是否相關(guān)并沒有相關(guān)研究。睡眠呼吸暫停的突出特征是夜間鋸齒樣的血氧波動，而間歇性低氧成為OSAS體外細胞模型的主要控制因素[6]，OSAS所造成的間歇低氧可導致氧化應激反應，而肺纖維化的發(fā)生發(fā)展和肺成纖維細胞的的活化也離不開氧化應激的作用[7]，所以O(shè)SAS的間歇低氧可能會引起肺成纖維細胞的活化，包括細胞外基質(zhì)的沉積和氧化應激產(chǎn)物的表達[8]，而這種活化又與FSTL1相關(guān)。本研究主要探討OSAS模式下的間歇低氧（IH）引起的氧化應激反應與FSTL1蛋白之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠原代肺成纖維細胞，胎牛血清（FBS），DMEM培養(yǎng)基，胰蛋白酶（美國Gibco公司），抗氧化劑Temple（Sigma公司），CAT試劑盒（南京建成公司），MDA試劑盒(南京建成公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基對小鼠原代肺成纖維細胞進行培養(yǎng)，并放在濕度合適、溫度37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。直至細胞在培養(yǎng)皿內(nèi)生長到80%～90%且細胞狀態(tài)良好，移除皿內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS小心清洗2遍，再加入1 mL的0.25%的胰蛋白酶消化，加入適量培養(yǎng)基，混勻吹打后，按2mL/孔的細胞量接種于P60細胞培養(yǎng)皿內(nèi)，至成纖維細胞長到80%～90%，PBS沖洗，轉(zhuǎn)移至撤去血清的培養(yǎng)基。

1.2.2 間歇低氧處理細胞 把分好盤的小鼠肺成纖維細胞放置于間歇低氧實驗設(shè)備內(nèi)，通過電路板和計算機程序（天津醫(yī)科大學總醫(yī)院呼吸科呼吸仿真系統(tǒng)）控制低氧/再氧合的循環(huán)（包括循環(huán)次數(shù)和循環(huán)時間）。間歇低氧的頻率為：低氧90s，復氧120s，用測氧儀調(diào)整低氧時實驗設(shè)備內(nèi)的氧濃度最低限度為5%，復氧時的氧濃度為21%，間歇低氧組細胞分別給予1、3、6、8 h的低氧再氧合的循環(huán)操作，對照組細胞放置在適宜的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h。

1.2.3 收集細胞分泌液，將上清液裝入EP管中，再加入適當裂解液，用刮板輕刮培養(yǎng)皿，將細胞裝入EP管中，均置于冰上待用。

1.2.4 提取胞內(nèi)蛋白，用全光譜酶標儀分別在450 nm、532 nm 處測過氧化氫酶（CAT），丙二醛（MDA）的吸光值，通過曲線換算，計算細胞內(nèi)含量。

1.2.5 分別提取上清內(nèi)蛋白和胞內(nèi)蛋白，用Western blot方法，檢測FSTL1和α-SMA表達的差異性以及趨勢變化。

1.2.6 用siRNA轉(zhuǎn)染的方法沉默成纖維細胞中FSTL1蛋白翻譯，并同樣間歇低氧處理8 h后，提取上清內(nèi)蛋白做Western blot，驗證是否沉默了FSTL1，提取胞內(nèi)蛋白，再次用全光譜酶標儀測CAT、MDA的吸光值，通過曲線換算，計算細胞內(nèi)含量。用提取的胞內(nèi)蛋白和上清蛋白，通過Western blot方法檢測Collagen 1蛋白和α-SMA蛋白的表達。沉默F(xiàn)stl1的SiRNA 序列為 Sense：CCAUCAACAUCACCACUUATT，Anti-sense：UAAGUGGUGAUGUUGAUGGTT；對照組的 SiRNA 序列為 Sense：UUCUCC GAACGUGUCACGUTT，Anti-sense：ACGUGACACG UUCGGAGAATT。所有的序列都是5′端到3′端。

2 結(jié)果

2.1 間歇低氧模式誘導氧化應激反應 見圖1。間歇低氧模式是一種利用正常氧濃度和低氧濃度交替循環(huán)來模擬睡眠呼吸暫停綜合征夜間低氧的方法，之前的研究表明，間歇低氧模式能夠誘導氧化應激反應，檢測的指標主要有丙二醛（MDA）含量，過氧化氫酶（CAT）活力等。為了檢驗間歇低氧模式下誘導的氧化應激反應，我們將小鼠肺成纖維細胞置于呼吸仿真系統(tǒng)倉內(nèi)，模擬間歇性低氧，檢測不同時間點細胞中過氧化氫酶活力以及丙二醛的含量。我們發(fā)現(xiàn)對照組的過氧化氫酶活力和丙二醛含量最低，而隨著低氧處理時間的增加，過氧化氫酶活力和丙二醛含量都呈現(xiàn)明顯上升趨勢。當在細胞培養(yǎng)基中加入抗氧化劑Temple處理8 h后，過氧化氫酶活力和丙二醛含量都顯著下降了。以上實驗說明間歇低氧模式確實能誘導氧化應激反應，并且與間歇低氧的時間成正相關(guān)性。

圖1 小鼠肺成纖維細胞在低氧模式下氧化應激產(chǎn)物CAT和MDA的表達Fig 1 Expression of oxidative stress products CAT and MDA in mouse lung fibroblasts in hypoxia mode

2.2 間歇低氧模式誘導肺成纖維細胞中Fstl1的表達 見圖2。利用Western Blot方法檢測不同時間點經(jīng)過間歇低氧處理的肺成纖維細胞中α-SMA和FSTL1的蛋白水平。結(jié)果顯示，α-SMA蛋白水平隨著低氧處理時間增加而明顯增加，同時FSTL1蛋白的表達量在對照組中最低，隨著間歇低氧處理時間越長，其表達量越高，而經(jīng)過抗氧化劑temple處理后，α-SMA和FSTL1蛋白的表達量都有明顯下降。以上數(shù)據(jù)說明間歇低氧能夠誘導肺成纖維細胞活化以及FSTL1蛋白的表達，并且與氧化應激反應具有一定相關(guān)性。

圖2 小鼠肺成纖維細胞在低氧模式下α-SMA和FSTL1的表達Fig 2 Expression of α-SMA and FSTL1 in mouse lung fibroblasts in hypoxic mode

2.3 敲低Fstl1減弱間歇低氧模式誘導的氧化應激反應 見圖3。我們利用Fstl1的siRNA敲低肺成纖維細胞中FSTL1的蛋白，Western blot顯示，siRNA確實降低了FSTL1蛋白的水平。而間歇性低氧處理后，細胞內(nèi)丙二醛含量和過氧化氫酶活力都明顯下降了。說明Fstl1參與調(diào)節(jié)間歇低氧模式的氧化應激過程。

圖3 敲低FSTL1表達后小鼠肺成纖維氧化應激產(chǎn)物CAT和MDA的表達Fig 3 Expression of CAT and MDA in lung fibroblastic stress products of mice after knockdown of FSTL1 expression

2.4 敲低Fstl1減弱間歇低氧模式誘導的肺成纖維細胞活化 見圖4。筆者進一步檢測了在Fstl1表達下降的情況下，間歇低氧處理后肺成纖維細胞中α-SMA蛋白以及培養(yǎng)基中細胞外基質(zhì)college1的表達量。結(jié)果顯示，α-SMA蛋白以及collegen1的含量都顯著下降，表明敲低Fstl1減弱間歇低氧模式誘導的肺成纖維細胞活化以及細胞外基質(zhì)的合成。

圖4 敲低FSTL1表達后小鼠肺成纖維細胞活化程度Fig 4 Activation of lung fibroblasts in mice after knockdown of FSTL1 expression

3 討論

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征是一種由多種原因引起的睡眠呼吸疾病，造成夜間的低通氣和白天嗜睡現(xiàn)象，臨床上常見的原因是上呼吸道的狹窄。長期的夜間呼吸暫停和低通氣，使得機體缺氧，血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等全身各個系統(tǒng)都受到間歇性低氧的影響，這種危害是廣泛而且不可逆的，甚至常發(fā)生夜間猝死現(xiàn)象。該疾病的治療方法主要有手術(shù)和非手術(shù)兩種[9]，非手術(shù)治療中以經(jīng)鼻持續(xù)正壓通氣（NCPAP）最為有效，手術(shù)治療的目的是消除或減輕呼吸道的阻塞，但這種方法個體性較強，有時不能完全治愈，會出現(xiàn)病情復發(fā)。FSTL1（Follistain-like 1）基因編碼一種胞外分泌的糖蛋白，其幾乎在所有的組織器官中均有表達[10]。研究表明，F(xiàn)STL1通過增強TGF-b信號而促進肺纖維化的發(fā)展，是一個新的促纖維化因子。然而FSTL1是否參與氧化應激反應誘導的肺成纖維細胞活化并沒有相關(guān)研究。有研究報道，F(xiàn)stl1在特發(fā)性肺纖維化以及矽肺的活化肺成纖維細胞中均有明顯上調(diào)。在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，間歇性低氧能夠誘導小鼠肺成纖維細胞的活化。本實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過間歇低氧處理后的FSTL1和α-SMA表達都高于正常組，且與低氧處理時間呈正相關(guān)[5，11-15]。用siRNA轉(zhuǎn)染沉默F(xiàn)STL1蛋白的表達，間歇低氧處理8 h后，α-SMA和collagen 1的表達量相較正常組都降低，氧化應激指標過氧化氫酶活力和丙二醛含量都下降，這在一定程度上表明FSTL1蛋白參與了此氧化應激的過程，與成纖維細胞的活化相關(guān)，有可能起到了促炎的作用。總的來說，睡眠呼吸暫停是一種全身性的疾病，對多個系統(tǒng)都有廣泛影響，而這種影響體現(xiàn)在間歇低氧的這一機制對系統(tǒng)的損害，應該引起更多臨床醫(yī)生和科研工作者的重視。特別是OSAS患者是否有更高的發(fā)生肺纖維化的風險或者更嚴重的肺纖維化。接下來，應該完善從具體的氧化應激相關(guān)通路上做進一步的分析，嘗試從信號分子上探索FSTL1蛋白和間歇低氧模式的關(guān)系，并搜集大量臨床數(shù)據(jù)分析OSAS是否為肺纖維化的獨立危險因素。