IL-6誘導卵巢癌細胞對他莫西芬產(chǎn)生耐藥的實驗研究

馬曉霞 ，孫 旸 ，馬 瑞 ，崔志坤 ，王 越 ，郭小芹 ，鄧為民

（1.天津醫(yī)科大學免疫學系，天津300070；2.武警后勤學院病原生物學教研室，天津300309；3.武警特色醫(yī)學中心婦產(chǎn)科，天津300163）

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，病發(fā)隱匿，大部分患者確診時已屬晚期，因此卵巢癌是婦科腫瘤中病死率最高的惡性腫瘤。作為雌激素依賴性腫瘤，雌激素與雌激素受體（estrogen receptor，ER）的相互作用可促進其發(fā)生發(fā)展[1-3]。他莫西芬（tamoxifen，TAM）是目前臨床上治療乳腺癌最具代表性的抗雌激素藥物，卵巢癌與乳腺癌雖然同為雌激素依賴性腫瘤，但二者對抗雌激素治療反應(yīng)不同。約2/3 ERα陽性的乳腺癌患者對TAM治療有效，而卵巢癌患者有40%～60%表達ERα，但僅有7%～18%的患者對抗雌激素治療有效，因此，探討卵巢癌在抗雌激素治療中發(fā)生耐藥的機制具有重要意義[4]。IL-6是由多種細胞產(chǎn)生的一種炎癥性細胞因子，臨床資料顯示，卵巢癌患者IL-6的高表達與不良預(yù)后及化療敏感性差密切相關(guān)[5-6]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細胞自分泌IL-6的水平與其對TAM的敏感性呈負相關(guān)。不分泌IL-6的A2780細胞對TAM敏感；而高分泌IL-6的CAOV3細胞對TAM耐藥[7]。IL-6是否影響卵巢癌細胞對TAM的敏感性？本研究對內(nèi)源性及外源性IL-6在誘導卵巢癌抗雌激素治療耐藥中的作用進行初步研究，從而為解決卵巢癌內(nèi)分泌治療耐藥這一難題提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑 二甲基亞砜（DMSO）：Sigma公司產(chǎn)品；噻唑藍（thiazolyblue，MTT）：Sigma公司產(chǎn)品。美國GIBCO公司產(chǎn)品：RPMI/1640培養(yǎng)基、活性碳處理的FBS（sFBS）；中美合資蘭州民海生物工程有限公司產(chǎn)品：胎牛血清（FBS）；美國R&D公司：重組人IL-6、人IL-6 ELISA試劑盒；美國Invitrogen公司產(chǎn)品：LipofectamineTM2000、G418；TaKaRa 產(chǎn)品：M-MLV（RNase H-）逆轉(zhuǎn)錄酶、2×Premix Taq；100bp DNALadderMarker產(chǎn)自天根生化科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞系和細胞培養(yǎng) 人卵巢腺癌細胞（A2780）和人乳突狀卵巢腺癌細胞（CAOV3）均為美國ATCC公司產(chǎn)物，前者購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，后者為本室保留。前者用含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，后者用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，該培養(yǎng)液含有100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。

1.2.2 基因轉(zhuǎn)染克隆的篩選與鑒定 A2780細胞不分泌IL-6但表達其受體，而CAOV3細胞高表達IL-6及其受體。前期工作[7]獲得中度和高度表達IL-6的2個A2780細胞克隆（A2780/ssIL-6M和A2780/ssIL-6H）及A2780/pcDNA3.1+。本研究將帶有反義IL-6 cDNA的表達載體pcDNA3.1+/asIL-6轉(zhuǎn)染至CAOV3細胞中，細胞轉(zhuǎn)染48 h后，應(yīng)用G418（濃度為600 μg/mL）進行加壓篩選獲得的陽性轉(zhuǎn)染細胞克隆經(jīng)擴大培養(yǎng)后分別收取培養(yǎng)上清和細胞進行ELISA和RT-PCR鑒定，獲得IL-6中度和高度抑制表達的2個CAOV3細胞克隆（CAOV3/asIL-6Mi和CAOV3/asIL-6Hi）。同時將空載體轉(zhuǎn)染至CAOV3細胞作為陰性對照，為CAOV3/pcDNA3.1+。

1.2.3 IL-6的ELISA檢測 取對數(shù)生長期的上述卵巢癌細胞，調(diào)整各種細胞濃度為1×105/mL，接種于12孔細胞培養(yǎng)板中，1 mL/孔，37℃、50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)上清，按照ELISA試劑盒的說明書檢測培養(yǎng)上清中IL-6的含量。

1.2.4 RT-PCR反應(yīng) 總RNA的提取的流程參照TRizol試劑（美國Invitrogen）說明書。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件參照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說明書進行，引物序列IL-6 如 下 ：IL-6:forward 5′-TTGACAAACAAA TTCGGTACA-3′，reverse 5′-GAGGTGCCCATGC T ACA-3′（497 bp）；β -actin:sense5′-TGGAATCCT GTGGCATCCATGAAAC-3′，antisense 5′-TAAAACG CAGCTCAGTAACAGTCC-3′（350 bp）。PCR反應(yīng)體系：cDNA 1.0 μL，2×PremixTaq 10 μL，上、下游引物各10 pmol，加雙蒸水至總體積20 μL。PCR反應(yīng)的程序如下：預(yù)變性，94 ℃ 5 min；變性，94 ℃ 30 s；退火，59℃45 s；延伸，72℃1 min，設(shè)定34個循環(huán)。反應(yīng)終止時，吸取5 μL PCR反應(yīng)液在濃度為12 g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳。結(jié)果使用Quantity One軟件（Bio-Rad公司）分析，內(nèi)參是β-actin，使用靶基因/β-actin的光密度比值對mRNA進行相對定量。

1.2.5 MTT試驗檢測細胞活性 應(yīng)用終濃度50ng/mL IL-6作用于A2780細胞，連續(xù)處理10 d，期間每2 d更換1次新鮮的培養(yǎng)液并加入相同濃度的IL-6，經(jīng)上述處理的細胞命名為IL-6預(yù)處理的A2780細胞（A2780/preIL-6細胞）。將A2780/preIL-6，A2780細胞分別接種到 96 孔板中（4×104/mL），100 μL/孔，37℃、50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，更換含有50 mL/L FBS的培養(yǎng)液，A2780/preIL-6細胞先加入20 μL終濃度為50 ng/mL的IL-6，然后與A2780細胞一起分別加入不同濃度的TAM（0.1、1、10、100、1 000 nmol/L），30 min后加入雌二醇（E2終濃度為1 nmol/L）。每個濃度設(shè)5個平行孔，并以TAM的稀釋液乙醇作為對照。37℃、50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)48 h后，在結(jié)束培養(yǎng)前4 h離心棄上清后加入 MTT 溶液(0.5 g/L，PBS配制)，于 37℃、50 mL/L CO2孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄MTT溶液后加入DMSO 100 μL/孔，充分振蕩至細胞內(nèi)的紫藍色結(jié)晶完全溶解，置酶標儀上測定波長為490 nm時的吸光度（A）值。同時，內(nèi)源性過表達IL-6的A2780/ssIL-6及抑表達IL-6的CAOV3/asIL-6細胞，同樣采取上述方法檢測其細胞活性。

1.3 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計學分析使用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，最終結(jié)果以±s表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LDS法，P＜0.05具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 asIL-6基因轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞克隆篩選的鑒定 由圖1a可見，與空載體轉(zhuǎn)染細胞CAOV3/pcDNA3.1+相比，IL-6中、高抑制表達的2個CAOV3細胞克隆，其IL-6分泌水平分別下降了63.82%和75.69%（P＜0.01），命名為 CAOV3/asIL-6Mi和 CAOV3/asIL-6Hi細胞，而未轉(zhuǎn)染細胞CAOV3與空載體轉(zhuǎn)染細胞CAOV3/pc DNA3.1+相比IL-6分泌水平無明顯差異。上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞克隆的IL-6 mRNA水平與其分泌水平相一致（圖1b）。

圖1 asIL-6基因轉(zhuǎn)染CAOV3細胞克隆的IL-6表達水平Fig 1 ThelevelofIL-6expressioninasIL-6-transfectedCAOV3cell

2.2 外源IL-6可以誘導A2780細胞對TAM產(chǎn)生耐藥 由圖2可見，經(jīng)不同濃度的TAM（0.1、1、10、100、1 000 nmol/L）作用后，A2780/preIL-6 細胞增殖水平均顯著高于A2780細胞（均P＜0.05）。說明外源性IL-6可以誘導A2780細胞對TAM產(chǎn)生耐藥。

圖2 外源性IL-6影響A2780細胞對他莫西芬的敏感性（MTT法）Fig 2 MTT assay for the effect of exogenous IL-6 on the sensitivity of A2780 cells to tasmoxifen

2.3 內(nèi)源性IL-6影響卵巢癌細胞對TAM的敏感性 如圖3a所示，經(jīng)不同濃度TAM作用后，A2780/ssIL-6M和A2780/ssIL-6H細胞的增殖水平均較空載體轉(zhuǎn)染細胞A2780/pcDNA3.1+明顯增加（均P＜0.05），與未轉(zhuǎn)染細胞A2780和空載體轉(zhuǎn)染細胞A2780/pcDNA3.1+比較，細胞增殖水平無明顯差異。表明內(nèi)源性過表達IL-6可誘導A2780細胞對TAM產(chǎn)生耐藥。而抑制內(nèi)源性IL-6表達可恢復CAOV3細胞對TAM的敏感性，如圖3b所示，與空載體轉(zhuǎn)染細胞CAOV3/pcDNA3.1+相比，CAOV3/asIL-6Mi和CAOV3/asIL-6Hi細胞增殖水平均顯著下降（均P＜0.05）。未轉(zhuǎn)染細胞CAOV3和空載體轉(zhuǎn)染細胞CAOV3/pcDNA3.1+相比，細胞增殖水平無明顯差異。上述結(jié)果提示IL-6可誘導卵巢癌細胞對TAM產(chǎn)生耐藥。

圖3 內(nèi)源性IL-6影響卵巢癌細胞對他莫西芬的敏感性（MTT法)Fig 3 MTT assay for the effect of endogenous IL-6 on the responsiveness of ovarian cancer cells to tamoxifen

3 討論

卵巢癌的發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌列居婦科惡性腫瘤第3位，而病死率在女性生殖系統(tǒng)癌癥中高居首位。作為一種雌激素依賴性腫瘤，流行病學表明雌激素替代治療可增加卵巢癌的發(fā)病風險；與正常絕經(jīng)后婦女相比，絕經(jīng)后卵巢癌患者血清中雌激素水平更高。一直以來，他莫西芬是卵巢癌抗雌激素治療的首選藥物。抗雌激素藥物可作為配體競爭性地與ER結(jié)合，通過誘導ER構(gòu)象改變而使ER的DNA結(jié)合區(qū)不能與靶基因上的雌激素反應(yīng)元件（estrogen response element,ERE）結(jié)合，由此阻斷了雌激素的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)。但根據(jù)受體狀態(tài)進行內(nèi)分泌治療的效果不佳[8-10]，具體機制尚不清楚。

IL-6是一種多功能細胞因子，其與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。IL-6通過影響細胞的粘附性和活動力、血栓形成、腫瘤特異性抗原的表達及腫瘤細胞的增殖而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。臨床資料表明卵巢癌患者高表達IL-6，其腹水中的水平明顯高于血清，IL-6水平升高與卵巢癌的不良預(yù)后及化療敏感性差相關(guān)[5]。體外實驗證明IL-6可增加卵巢癌細胞的粘附性、趨化性及總侵襲力；卵巢癌細胞產(chǎn)生的IL-6是一種潛在的前血管生成因子；并可通過促進MMP-9分泌而提高其致瘤性[6,11]。目前，國內(nèi)外對IL-6在雄激素依賴性腫瘤前列腺癌細胞生長和抗雄激素治療中作用及相關(guān)機制的研究相對較多。對IL-6在雌激素依賴性腫瘤乳腺癌和卵巢癌細胞生長中的作用報道較少，如有研究表明IL-6對乳腺癌細胞生長有抑制作用[12]，但對其轉(zhuǎn)移卻有促進作用；研究發(fā)現(xiàn)IL-6不僅可促進卵巢癌細胞生長，同時還證明雌激素對卵巢癌細胞的促生長作用有部分是由IL-6介導的[13-14]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，人卵巢癌細胞自分泌IL-6水平與其對TAM的敏感性呈負相關(guān)，提示IL-6可能在卵巢癌內(nèi)分泌治療耐藥中發(fā)揮作用。本研究利用內(nèi)源性和外源性IL-6處理的卵巢癌細胞作為模型，觀察IL-6在卵巢癌細胞對TAM敏感性中的作用。結(jié)果表明，外源性IL-6和內(nèi)源性過表達IL-6均可明顯促進卵巢癌細胞的增殖水平，提示IL-6可誘導卵巢癌細胞對TAM產(chǎn)生耐藥，而抑制內(nèi)源性IL-6表達則明顯降低卵巢癌細胞的增殖水平，表明抑制IL-6表達可恢復卵巢癌細胞對TAM的敏感性。

本研究從正反兩方面證實IL-6可誘導卵巢癌細胞對TAM產(chǎn)生耐藥，對IL-6在誘導卵巢癌細胞對TAM產(chǎn)生耐藥中的作用進行初步探討，不僅有助于幫助筆者預(yù)測治療的療效，而且有望為逆轉(zhuǎn)卵巢癌抗雌激素治療耐藥提供新的靶點。然而IL-6誘導卵巢癌細胞抗雌激素治療產(chǎn)生耐藥的分子機制尚不清楚，有待進一步研究。