Sedlin突變體的表達及其與RB1在細胞中的共定位

何 葉，潘林鑫，張 永，范禮斌，劉曉穎

遲發性脊椎骨骺發育不良基因(spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDL)編碼的Sedlin蛋白在內質網-高爾基體中間體(ER-golgi intermediate compartment, ERGIC)囊泡運輸中發揮關鍵作用[1-2]。分析X-連鎖遲發性脊椎骨骺發育不良(spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDT)病例，結果顯示患者SEDL發生多種突變，導致Sedlin蛋白定位異常，且Sedlin蛋白羧基端的完整有利于其在ERGIC的定位，突變最終導致軟骨發育功能異常[3-4]。

最普遍的調節蛋白質活力及功能的方式是蛋白質磷酸化，酪氨酸位點的磷酸化除了在變構及激活該蛋白的活力外，更重要的是促進其和結合蛋白相互作用而形成多蛋白復合體[5]。本實驗室前期已證實Sedlin與視網膜母細胞瘤蛋白(RB1)在哺乳動物細胞內存在相互作用[6]，該研究旨在探討Sedlin的C端缺失及磷酸化位點突變是否影響Sedlin的亞細胞定位及其與RB1的共定位。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞、質粒和菌株 本實驗所用的COS7細胞、HEK 293T細胞，載體pCDGFP、pGEX-3X，Sedlin相關質粒，TG1、BL21、DH5α菌株等均為本實驗室保存。

1.1.2主要試劑 PrimeSTAR酶(日本TaKaRa公司)；BamH I、EcoR I限制性內切酶、T4 DNA連接酶、Dpn I酶；DMEM高糖培養基(北京賽默飛世爾科技有限公司)；質粒提取試劑盒(美國OMEGA公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；Lipofectamine 2000、Opti-MEM(美國Invitrogen公司)；GFP抗體(美國Santa Cruz公司)；FLAG抗體(美國Sigma公司)；細胞裂解液(上海碧云天生物技術有限公司)；SuperSignal West Pico顯色試劑盒(美國Pierce公司)；IPTG、PMSF、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG和TRITC標記山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)；谷胱甘肽瓊脂糖球珠(美國GE Healthcare公司)；熒光封片膠(丹麥DAKO公司)；熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss Jena公司)。

1.2 方法

1.2.1Sedlin缺失突變體和點突變體的序列擴增[6]以Sedlin全長cDNA序列為模板，25 μl PCR體系進行擴增：模板DNA 10 ng(0.5 μl)，上下游引物濃度均為20 pmol/μl(0.5 μl)，Prime STAR酶12.5 μl，ddH2O 11 μl。

1.2.2Sedlin缺失突變體的構建[6]對上述擴增產物進行電泳，凝膠試劑盒進行回收，將得到的PCR產物用限制性內切酶BamH I和EcoR I進行雙酶切，并同樣雙酶切pCDGFP載體、pGEX-3X載體，將酶切后的產物用T4 DNA連接酶連接(16 ℃ 連接約12 h)，然后轉化TG1感受態細胞并平板培養； 10 h后選取單克隆挑菌，37 ℃恒溫振蕩培養12 h進行質粒抽提，最后用BamH I和EcoR I進行酶切鑒定；選酶切鑒定正確的質粒送公司測序。

1.2.3Sedlin點突變體的構建[6]20 μl擴增產物加入Dpn I酶1.5 μl，37 ℃ 水浴2 h，轉化DH5α感受態細胞，平板培養約12～16 h后，挑取單克隆37 ℃振蕩過夜培養；最后抽提質粒并進行雙酶切鑒定，選取酶切鑒定正確的質粒送公司測序。

1.2.4細胞培養及轉染 用含有100 U/ml青、鏈霉素及5%胎牛血清的DMEM高糖培養基于37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養COS7細胞、HEK 293T細胞。細胞長滿單層時傳代，次日將重組質粒(μg) ∶Lipofectamine 2000按1 ∶2的比例轉染至HEK 293T細胞，用于檢測蛋白表達；將重組質粒(μg)：Lipofectamine 2000按1 ∶1.5轉染至COS7細胞，用于免疫熒光實驗。

1.2.5GST-SedlinN、GST-Sedlin-Y115A、GST-Sedlin-Y115F融合蛋白的表達及純化 把pGEX-3X-SedlinN/Y115A/Y115F重組質粒轉化至BL21感受態細胞，挑取單克隆至含有氨芐抗性的2 ml LB培養基中，37 ℃ 振蕩培養12 h；取50 μl菌液到含有氨芐抗性5 ml LB中擴大培養，當OD600值達0.4～0.6范圍時再按照GST-Sedlin融合蛋白的最佳誘導條件摸索制備GST-SedlinN、GST-Sedlin-Y115A、GST-Sedlin-Y115F的誘導條件，按照最佳條件誘導(pGEX-3X-SedlinN為0.05 mmol/L的IPTG,16 ℃誘導12 h，pGEX-3X-Sedlin-Y115A、pGEX-3X-Sedlin-Y115F為0.01 mmol/L的IPTG，30 ℃ 誘導4 h)，誘導結束后收集細菌并用含終濃度0.1 mmol/L的PMSF和DTT的細菌裂解液裂解約30 min，再適當超聲以促進細胞裂解；4 ℃ 、14 000 r/min離心20 min，取上清液，每管1 ml分裝至1.5 ml EP管，保存于-80 ℃。取1份制備好的融合蛋白用谷胱甘肽瓊脂糖球珠對其進行純化并制成樣品，SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色后凝膠成像儀拍照，檢測融合蛋白是否成功誘導表達。

1.2.6Western blot法檢測蛋白表達 轉染48 h后收集細胞，加適量細胞裂解液，4 ℃ 孵育25～30 min，4 ℃ 、14 000 r/min離心20 min，取適量蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳；100 V電轉1 h；PVDF膜于5%脫脂奶粉中封閉1.5 h，TBST洗膜(10 min、3次)，GFP兔抗(1 ∶1 000)4 ℃ 孵育過夜，TBST洗膜(10 min、3次)，二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜(10 min、3次)，ECL顯影。

1.2.7免疫熒光實驗 轉染后約24 h取出COS7細胞爬片，用PBS清洗細胞(5 min、3次)，-20 ℃的甲醇固定5 min，再用70%乙醇溶液固定細胞5 min，PBS清洗(5 min、3次)；1%脫脂奶粉封閉30 min，FLAG一抗室溫孵育2 h，TRITC標記的山羊抗小鼠IgG孵育1 h；DAPI染核2 min，PBS清洗細胞(5 min、3次)，DAKO封片膠封片；熒光顯微鏡下觀察、拍攝。

2 結果

2.1 Sedlin突變體重組質粒的酶切鑒定和測序結果分別對重組質粒pGEX-3X-SedlinN/Y115A/Y115F和pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F進行雙酶切(BamH I、EcoR I)，結果見圖1A、1B。各重組質粒均被切成兩條帶，一條帶與載體大小一致(A載體為pGEX-3X，約4 900 bp；B載體為pCDGFP，約6 100 bp)，另一條帶與目的片段大小一致(SedlinN為330 bp，Sedlin-Y115A/Y115F為420 bp)。上述質粒的測序結果經比對，證實各質粒成功構建，見圖1C、1D。

2.2 Sedlin突變體在原核細胞中的表達分別轉化pGEX-3X-SedlinN/Y115A/Y115F質粒至BL21菌株，經IPTG誘導培養后，收集菌體進行裂解，經谷胱甘肽瓊脂糖珠子純化后進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色結果顯示，純化后的樣品分別在約37 ku(圖2A)和40 ku(圖2B)的位置出現很強的蛋白條帶，大小符合GST-SedlinN、GST-Sedlin-Y115A、GST-Sedlin-Y115F融合蛋白，表明融合蛋白表達成功。

2.3 Sedlin突變體在HEK 293T細胞中的表達轉染后約48 h，收集細胞并進行裂解，將細胞總蛋白進行Western blot檢測，結果顯示轉染了pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F的細胞裂解液均能檢測到條帶，與預染的蛋白Marker對比，過表達的pCDGFP-SedlinN分子量為39 ku，點突變體pCDGFP-Sedlin-Y115A、pCDGFP-Sedlin-Y115F的分子量約為42 ku，與野生型pCDGFP-Sedlin的分子量一致，表明Sedlin突變體在HEK 293T細胞中正常表達。見圖3。

圖1 重組質粒的酶切鑒定及測序結果圖

A、B：重組質粒的酶切鑒定圖；C、D：重組質粒的測序結果圖；M1：Lambda DNA/EcoR I+HindⅢ Marker；M2：TaKaKa DL2000 Marker；1：pGEX-Sedlin的酶切鑒定結果；2：pGEX-SedlinN的酶切鑒定結果及測序圖；3：pGEX-Sedlin-Y115A的酶切鑒定結果及測序圖；4：pGEX-Sedlin-Y115F的酶切鑒定結果及測序圖；5：pCDGFP-Sedlin的酶切鑒定結果；6：pCDGFP-SedlinN的酶切鑒定結果及測序圖；7：pCDGFP-Sedlin-Y115A的酶切鑒定結果及測序圖；8：pCDGFP-Sedlin-Y115F的酶切鑒定結果及測序圖

圖2 考馬斯亮藍染色檢測谷胱甘肽瓊脂糖球珠純化后的融合蛋白

M：標準蛋白Marker梯度；1：GST的細菌裂解液；2：GST-SedlinN的細菌裂解液；3：GST的純化蛋白；4：GST-SedlinN的純化蛋白；5：GST-Sedlin-Y115A的細菌裂解液；6：GST-Sedlin-Y115F的細菌裂解液；7：GST-Sedlin-Y115A的純化蛋白；8：GST-Sedlin-Y115F的純化蛋白

圖3 Sedlin突變體蛋白在哺乳動物細胞中的表達

1：轉染pCDGFP-Sedlin的HEK 293T細胞裂解液；2：轉染pCDGFP-SedlinN的HEK 293T細胞裂解液；3：轉染pCDGFP-Sedlin-Y115A的HEK 293T細胞裂解液；4：轉染pCDGFP-Sedlin-Y115F的HEK 293T細胞裂解液

2.4 Sedlin突變體蛋白在COS7細胞中的定位分別單轉Sedlin突變體pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F至COS7細胞中，然后進行免疫熒光制片、顯微拍攝，結果顯示它們在細胞核與細胞質中均有表達，且細胞核表達量較高，見圖4A，這一結果與野生型Sedlin的定位基本一致，見圖4B。表明Sedlin的C端缺失后，以及C端磷酸化位點突變后并未影響其亞細胞定位。

2.5 Sedlin突變體蛋白與RB1蛋白的共定位分別共轉Sedlin突變體質粒pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F與pcDNA3.1-FLAG-RB1至COS7細胞中，進行免疫熒光制片、顯微拍攝，結果顯示它們與RB1蛋白在核內均存在明顯的共定位，表明Sedlin的C端缺失后，以及C端磷酸化位點突變后并未影響其與RB1的共定位(圖5A、5B)，提示Sedlin的N端可能是與RB1相互結合的重要結構域。

3 討論

SEDT是一種軟骨發育功能障礙疾病，病變主要累及身體承重大關節，以退行性大關節炎和短軀干性侏儒為主要臨床表現[1]。SEDT為X-連鎖隱性遺傳，具有高度遺傳性[7]。高度保守的Sedlin蛋白，在心臟、腎臟、骨骼肌等組織中均有分布。相關定位研究[8]表明Sedlin蛋白在哺乳動物細胞COS7中與ERGIC在細胞核周圍有部分共定位現象。現階段研究普遍認為SEDT的發病原因可能是SEDL基因突變導致Sedlin功能異常，軟骨細胞不能正常分泌細胞外基質，進而引起骨骼發育異常。SEDT相關的Sedlin突變不會導致亞細胞定位的異常，但涉及疏水核心內殘基的突變會導致其與轉錄因子MBP1、PITX1和SF1相互作用的喪失[9]。Sedlin的二聚化及其核定位表明哺乳動物Sedlin的其他作用；據報道其與酵母中的Sedlin同源物Trs20p已經作為TRAPP復合物中的單體存在[10]，其中Sedlin在內質網-高爾基體的膜泡轉運中發揮重要作用。人Rb1基因全長178 143 bp，定位于染色體13q14，編碼約104～110 ku的核內磷酸化蛋白pRb[11]。RB1蛋白幾乎在所有正常細胞中表達，但表達量存在組織和發育階段的差異，在視網膜、心臟和肌肉中較高，肝臟、胸腺和腦中較低，且隨年齡的增長，表達量在各組織中均有顯著下降。RB1蛋白具有包括參與細胞周期、細胞分化、細胞凋亡的調控等功能，RB1的抑癌作用與這些功能的正常發揮密不可分[12]。

圖4 Sedlin及其突變體蛋白在COS7細胞中的定位

A：Sedlin突變體蛋白(SedlinN/Y115A/Y115F)在COS7細胞中的定位；B：Sedlin蛋白在COS7細胞中的定位；GFP：顯示含GFP標簽的蛋白；DAPI：顯示染色的細胞核；Merge：疊加效果

圖5 Sedlin突變體蛋白與RB1蛋白在COS7細胞中的共定位

A：Sedlin突變體蛋白(SedlinN/Y115A/Y115F)與RB1蛋白在COS7細胞中的共定位；B：Sedlin蛋白與RB1蛋白在COS7細胞中的共定位；TRITC:含FLAG標簽的RB1蛋白；GFP：顯示含GFP標簽的蛋白；DAPI：顯示染色的細胞核；Merge：疊加效果

本研究通過構建pCDGFP-SedlinN、pCDGFP-Sedlin-Y115A、pCDGFP-Sedlin-Y115F真核表達質粒，并將其分別轉染至COS7、HEK 293T細胞，比較 Sedlin突變體相對于野生型在真核細胞內的表達和定位改變。鑒于本課題組前期已證實野生型Sedlin蛋白與RB1蛋白存在共定位，所以又分別將上述幾個質粒與FLAG-RB1質粒共轉至COS7細胞中，了解Sedlin突變體蛋白與RB1蛋白的共定位情況。將Sedlin的三個突變體構建到原核表達載體pGEX-3X中，誘導表達GST融合蛋白，通過SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白表達情況。

構建的兩個點突變體在DNA水平條帶大小相對于野生型而言無明顯變化，只是DNA序列中對應位置堿基種類發生變化，而總的堿基數不變，除了Tyr115Phe、Tyr115Ala突變體以外，常見的Sedlin突變體還有Asp47Tyr、Ser73Leu、Phe83Ser和Val130Asp，根據相關文獻[9]中對Sedlin三維結構分析得知，Sedlin突變體(Ser73Leu、Phe83Ser、Val130Asp)位于Sedlin的疏水核心結構域內，因此可能會影響 Sedlin的結構完整性以及與其他蛋白的相互作用。例如，極性Ser73到Leu73的突變將導致疏水性溝槽的破壞從而導致氫鍵的損失。類似地，Phe83和Val130殘基處于疏水區域內蛋白質的內部，這些非極性殘基突變為極性殘基(分別為絲氨酸和天冬氨酸)可能會破壞疏水核心內的相互作用，導致Sedlin的錯誤折疊，這將破壞蛋白質-蛋白質相互作用[9]。

pCDGFP-SedlinN、pCDGFP-Sedlin-Y115A、pCDGFP-Sedlin-Y115F幾個突變體在HEK 293T細胞里均有表達，且缺失突變體的蛋白分子量低于野生型及其點突變體，但是分子量變化不大，這是因為SEDL基因的編碼區423 bp，而編碼Sedlin的缺失突變體(N端)的基因有339 bp，結果證明缺失了Sedlin的C端以后Sedlin的缺失突變體(N端)依然能正常表達。免疫熒光結果顯示突變體pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F在細胞質與細胞核中均有表達，與野生型Sedlin的定位情況基本一致，表明上述突變均不會改變Sedlin蛋白的亞細胞定位，結合本文中上述免疫熒光實驗結果證明的RB1蛋白與SedlinN/Y115A/Y115F突變體蛋白在COS7中均存在共定位，說明Sedlin的第115位氨基酸(磷酸化位點)突變后(Tyr115Phe、Tyr115Ala)并不會導致其與RB1蛋白共定位的改變；同時由于RB1蛋白與SedlinN蛋白存在共定位情況，可以得出初步結論：Sedlin蛋白與RB1蛋白相互作用的部位可能是Sedlin蛋白的N端。

本研究重點關注Sedlin的3個突變體蛋白的表達及其與RB1蛋白在細胞內的共定位情況，將為本課題組后續研究Sedlin與RB1相互作用的詳細機制提供依據，為進一步揭示人類Sedlin蛋白在細胞中的作用機制、與相關疾病的關系等奠定一定的基礎。