Pes1通過PI3K/AKT/GSK-3β信號通路對膽汁淤積性肝病小鼠的作用

楊仁俊，汪 婧，孫 頡，張 娜，孔德潤

膽汁淤積性肝病在人群及臨床中非常常見，它可由各種原因引起的膽汁生成、分泌和排泄障礙，導致膽汁在肝內(nèi)淤積，而引起的肝細胞、肝內(nèi)外膽管一系列器質(zhì)性損害和功能性異常的肝膽系統(tǒng)疾病[1-2]。此病預后較差，無令人滿意的治療方案。Pescadillo 同源蛋白1 (Pescadillo homologue 1,Pes1)最初在斑馬魚的胚胎中被發(fā)現(xiàn)，與增殖阻斷蛋白1(block of proliferation 1,BOP1)和WD重復蛋白12(WD repeat domain 12,WDR12)結合形成穩(wěn)定的復合物，對于核糖體60 S亞基的合成至關重要[3]。Pes1是一種核仁蛋白，在鼠或人的正常胚胎發(fā)育和細胞周期調(diào)控中起重要作用。Pes1在其基序中含有保守的乳腺癌易感基因末端結構域，考慮到此結構域作為響應DNA損傷反應的整合信號模塊，Pes1也可能參與DNA損傷和修復[4]。糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)是已知在細胞凋亡信號傳導中重要的絲氨酸/蘇氨酸激酶[5]。該研究以膽汁淤積性肝病小鼠為模型，研究Pes1以及PI3K/AKT/GSK-3β信號通路中的蛋白在膽汁淤積性肝病小鼠中的表達，旨在更好地了解Pes1以及PI3K/AKT/GSK-3β信號通路在膽汁淤積性肝病中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑20只6～7周齡的SPF級雄性C57BL/6小鼠購自南京模式動物研究所。總膽汁酸(total bile acid，TBA)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(glutamyl transpeptidase，GGT)測試盒均購自南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄反應試劑盒、實時定量熒光PCR(RT-PCR)專用試劑盒購自日本TaKaRa公司；PCR引物購自上海生工生物工程股份有限公司；多聚甲醛固定液、RIPA裂解液以及特超敏ECL化學發(fā)光試劑盒均購自上海碧云天生物技術研究所；Western blot一抗Pes1、β-actin、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)、p-PI3K、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)、磷酸化Akt絲氨酸473位點(phospho-Akt ser473，p-Akt473)、磷酸化Akt蘇氨酸308位點(phospho-Akt thr308，p-Akt308)、GSK-3β、p-GSK-3β均購自美國abcam公司；Western blot二抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG)均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 動物造模與處理所有小鼠在安徽醫(yī)科大學動物中心飲食飲水，溫度控制在20～26 ℃，濕度控制在50%左右，12 h光照周期單籠喂養(yǎng)。所有小鼠適應環(huán)境，正常飲食飲水1周后，隨機分組，每組10只。對照組C57BL/6喂食普通基礎飼料4周，實驗組C57BL/6喂養(yǎng)含有0.1% 3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氫-2,4,6-三甲基吡啶(3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine，DDC) 飼料4周。在實驗麻醉之前先稱量每只小鼠體質(zhì)量，之后均先按小鼠每0.1 ml/10 g體質(zhì)量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，之后心臟取血獲取血清，-80 ℃下保存；取肝臟用冰PBS清洗后立即在液氮中急速冷卻，置-80 ℃儲存。

1.3 方法

1.3.1肝臟病理學觀察 取小鼠肝臟用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，做常規(guī)病理HE染色，在光學顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.3.2小鼠血清生化指標檢測 取小鼠血清，按照生化試劑測試盒說明書操作檢測血清TBA、TBIL、AKP、GGT水平。

1.3.3Western blot 用RIPA裂解液補充1%蛋白酶抑制劑和2%磷酸酶抑制劑的總混合物在冰上操作提取肝組織總蛋白。各蛋白樣品通過BCA試劑盒測定濃度并用RIPA配制成相同濃度，將每組蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液充分混合后，將其在100 ℃金屬浴下煮沸10 min，使蛋白變性并在SDS-PAGE凝膠中進行電泳，并以恒流200 mA將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%BSA封閉液封閉1～1.5 h。之后的膜與Pes1、β-actin、PI3K、p-PI3K、AKT、p-Akt473、p-Akt308、 GSK-3β、p-GSK-3β等一抗4 ℃孵育過夜，用TBST清洗3次，每次10 min，在室溫下與二抗(1 ∶5 000)孵育1～1.5 h，再次用TBST清洗后顯影，應用自動凝膠成像儀曝光顯影采集圖像。

1.3.4RT-PCR 使用TRIzol試劑提取肝組織的總RNA，然后測RNA濃度，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照說明書進行RT-PCR，擴增cDNA，以β-actin為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法分析計算mRNA表達量。每次實驗重復3次。Pes1正向引物：5＇-CCCAGTGGGTCTTTGACTGT-3＇，反向引物：5＇-ACGAAGGGTGAAAGATGTGG-3＇；β-actin正向引物：5＇-CTCTCCCTCACGCCATC-3＇，反向引物：5＇-ACGCACGATTTCCCTCTC-3＇。

2 結果

2.1 膽汁淤積性小鼠及正常小鼠體質(zhì)量檢測在喂養(yǎng)的4周內(nèi)，DDC模型小鼠隨著喂食時間增加出現(xiàn)呆滯少動，皮膚黃染；對照組小鼠情況基本正常。解剖后DDC模型小鼠有腹膜黃染，肝臟色稍黃，質(zhì)稍硬；正常組小鼠肝臟呈粉紅色、光滑柔軟。開始喂養(yǎng)時正常對照組小鼠體質(zhì)量為(24.32±0.19)g，與DDC組小鼠體質(zhì)量(24.19±0.46)基本一致，差異無統(tǒng)計學意義。喂養(yǎng)4周后DDC小鼠體質(zhì)量為(18.32±1.13)g，與對照組正常C57BL/6小鼠(25.30±0.94)g比較，DDC模型小鼠體質(zhì)量明顯減輕，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.83，P<0.05)。見圖1。

圖1 4周后小鼠體質(zhì)量變化1：對照組；2：DDC實驗組;與對照組比較： *P<0.05

2.2 小鼠肝組織病理學觀察肝臟常規(guī)病理HE染色光學顯微鏡下顯示，對照組小鼠肝組織結構基本正常，膽管周圍基本無炎性細胞，而DDC模型小鼠肝組織中可見匯管區(qū)擴大，匯管區(qū)以及膽管周圍大量炎性細胞浸潤，膽管變形以及膽管增生。見圖2。

圖2 小鼠肝組織光學顯微鏡下表現(xiàn) HE×200A：對照組；B：DDC實驗組

2.3 小鼠血清生化指標水平與對照組C57BL/6比較，膽汁淤積性肝病小鼠血清中TBA水平明顯增加(t=18.46，P<0.01)，見圖3A；膽汁淤積性肝病小鼠血清中TBIL水平明顯增加(t=9.64，P<0.01)，見圖3B；膽汁淤積性肝病小鼠血清中AKP活力明顯增加(t=4.88，P<0.01)，見圖3C；膽汁淤積性肝病小鼠血清中GGT水平明顯增加(t=6.79，P<0.01)，見圖3D。

圖3 小鼠血清生化指標的水平

A：TBA；B：TBIL；C：AKP活力；D：GGT；1：對照組；2：DDC實驗組；與對照組比較：**P<0.01

2.4 膽汁淤積性小鼠以及正常小鼠肝臟中Pes1的表達水平Western blot和RT-PCR檢測膽汁淤積性小鼠以及正常小鼠肝臟中Pes1蛋白以及mRNA的表達。GraphPad Prism 6.02分析顯示，膽汁淤積性小鼠肝臟中Pes1蛋白(t=11.85，P<0.01)及mRNA(t=5.33，P<0.01)的表達水平均低于正常小鼠肝臟組織，兩者結果是一致的。見圖4。

2.5 膽汁淤積性小鼠中PI3K/AKT/GSK-3β信號通路中蛋白表達的水平Western blot法檢測小鼠肝臟中PI3K/AKT/GSK-3β蛋白的表達。與對照組比較，膽汁淤積性肝病小鼠即DDC模型小鼠肝臟中總的PI3K蛋白表達水平無明顯變化，而p-PI3K呈低表達，與對照組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=16.23，P<0.01)，見圖5A；兩組小鼠肝臟中總的AKT蛋白表達水平無明顯變化，而DDC小鼠肝臟中p-Akt473、p-Akt308呈低表達，與對照組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.62、8.62，P<0.05)，見圖5B；兩組小鼠肝臟中總的GSK-3β蛋白表達水平無明顯變化，而DDC小鼠肝臟中p-GSK-3β也是呈低表達，與對照組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.10，P<0.05)，見圖5C。

圖4 小鼠肝臟中 Pes1 蛋白和mRNA的表達水平

A：Pes1在肝臟中蛋白的表達；B:Pes1在肝臟中mRNA的表達；1：對照組；2：DDC實驗組；與對照組比較：**P<0.01

3 討論

膽汁淤積性肝病如常見的原發(fā)性硬化性膽管炎好發(fā)于青壯年男性，起病較隱匿，以進行性肝內(nèi)和肝外纖維閉塞性膽管炎為特征，引起肝內(nèi)大膽管節(jié)段性狹窄，膽管閉塞，最終可發(fā)展為肝硬化和肝衰竭[6]。而小鼠DDC喂養(yǎng)是膽汁淤積性肝病的一種成熟模型，本研究中的DDC小鼠模型就是以肝內(nèi)大膽管損傷為主要特點的原發(fā)性硬化性膽管炎的動物模型，隨著造模時間的延長，出現(xiàn)膽管損傷、節(jié)段性膽管狹窄梗阻，長期持續(xù)性的膽汁淤積將進展為肝纖維化甚至肝硬化[7]。因此，上述模型是研究膽汁淤積肝病的發(fā)病機制和尋找治療藥物研究的理想模型。本研究旨在探討Pes1以及PI3K/AKT/GSK-3β信號通路在膽汁淤積性肝病中的表達和作用，有助于將Pes1開發(fā)為膽汁淤積性肝病治療的一個新靶點。

Pes1不僅參與核糖體生物發(fā)生即制造核糖體的過程，對細胞生長、增殖和動物正常發(fā)育至關重要[3]， Pes1還參與調(diào)節(jié)DNA損傷應答與修復。有研究[8-9]表明，Pes1可直接結合DNA并調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，是一種多功能蛋白質(zhì)，除了胚胎發(fā)育外，還有助于多種生理過程。此外，Pes1的沉默表達可以使AKT /GSK-3β信號通路失活[10]。同時，研究[11-12]表明，PI3K/AKT/GSK-3β信號傳導通路在細胞中是廣泛存在的，通過調(diào)節(jié)多種與細胞代謝、生長、凋亡及分化等過程，抑制細胞凋亡，而且可保護肝細胞免受膽汁酸所誘導的細胞凋亡。GSK-3β是一種多功能激酶，不僅在糖原代謝中起作用，還參與細胞凋亡，且已知它是細胞程序性死亡的上游調(diào)節(jié)因子，可促進 Caspase-3活化，活化的Caspase-3參與許多監(jiān)管程序，是細胞凋亡的執(zhí)行者；GSK-3β還會導致線粒體中細胞色素 C 釋放，進一步誘導細胞凋亡。活化的AKT通過磷酸化GSK-3β上的殘基絲氨酸-9，而抑制其生物活性，即磷酸化 GSK-3β(p-GSK-3β)是非活性的狀態(tài)，從而抑制了Caspase-3 的活化以及細胞色素C 的釋放，抑制肝細胞的凋亡，并減少細胞損傷[13-14]。

圖5 兩組小鼠中PI3K/AKT/GSK-3β信號通路中蛋白表達的變化

A：肝臟中PI3K、 p-PI3K的表達； B：肝臟中AKT及其磷酸化蛋白的表達； C：肝臟中GSK-3β、p-GSK-3β的表達；1：對照組；2：DDC實驗組；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

實驗結果表明，由于長期食用DDC,導致小鼠膽汁淤積性肝病的發(fā)生，膽汁淤積，在排泄過程中出現(xiàn)異常，致膽汁淤積性肝病小鼠血清中TBA等生化指標水平較對照組明顯增加。另外，在此研究中首次證明,與對照組小鼠比較，Pes1在膽汁淤積性肝病小鼠即DDC實驗組中mRNA和蛋白均下調(diào)。同時，在膽汁淤積性肝病小鼠中p-PI3K、p-Akt473、p-Akt308、p-GSK-3β蛋白較對照組表達水平降低，而總的PI3K、 AKT、GSK-3β無明顯變化。結果表明在膽汁淤積性肝病中由于Pes1表達水平降低，其機制是降低的Pes1使 PI3K/AKT/GSK-3β信號通路失活，由此依次降低PI3K和 AKT的磷酸化水平，最終下調(diào)了磷酸化GSK-3β的表達，使磷酸化GSK-3β對肝細胞凋亡的抑制、減輕細胞損傷的作用減弱，從而進一步加重了膽汁淤積性肝病的發(fā)生發(fā)展，提示Pes1可能是對膽汁淤積性肝病起到保護的作用，這一發(fā)現(xiàn)為進一步了解和治療膽汁淤積性肝病提供了新的見解。但是在細胞中和組織中增強Pes1的表達，并通過經(jīng)典的PI3K/AKT/GSK-3β信號通路，使之起到對膽汁淤積性肝病的保護作用并改善治療膽汁淤積性肝病有待進一步的研究。