復方甘草清瘍合劑HPLC 指紋圖譜

吳逸晨， 謝 輝， 毛春芹， 張夢晨

（南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京210046）

復方甘草清瘍合劑是由甘草、珍珠母、黃連、黃芩、干姜等藥味組成，根據南京市中醫院臨床有效經驗方研制而成的新制劑，臨床用于治療脾胃虛弱引起的復發性口腔潰瘍等病癥，具有顯著療效。

中藥指紋圖譜是一種被國內外廣泛接受的質量評價手段，可以提供豐富的鑒別信息，反映中藥復雜化學體系的整體性質，對中藥質量的控制有重要意義。在構建現代中藥質量標準體系框架的過程中，中藥指紋圖譜應當作為核心技術［1］。因此，為了更好地控制制劑質量，獲得穩定的療效，本研究采用HPLC 研究并建立了復方甘草清瘍合劑的指紋圖譜，以期為其質量控制提供依據。

1 材料

Waters 2695 高效液相色譜儀 （美國Waters 公司）；TGL-16C 高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；CAV64C 電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）。乙腈、甲醇（均為色譜純，美國Tedia 公司）；磷酸（分析純，上海凌峰化學試劑有限公司）；甲醇（分析純，無錫市亞盛化工有限公司）；水為超純水。

甘草 酸 單 銨 鹽 （批 號201803）、 黃 芩 素 （批 號200571）、鹽酸小檗堿（批號200915）、鹽酸黃連堿（批號201118）、鹽酸巴馬汀（批號200908）、表小檗堿（批號201214）、6-姜辣素（批號201838） 均購自上海源葉生物科技有限公司；黃芩苷（批號200514） 購自中國食品藥品檢定研究院；漢黃芩素（批號64320010） 購自上海安譜實驗科技股份有限公司，對照品含有量均大于98.0%。甘草、黃連、黃芩等飲片由安徽省金芙蓉中藥飲片有限公司提供；珍珠母、干姜等飲片由四川新荷花中藥飲片股份有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 樣品制備及處理

2.1.1 全方制劑 按復方甘草清瘍合劑制備工藝，制備10 批 制 劑 （S1 ～S10）， 批 號 分 別 為180701、 180702、180703、 180704、 180705、 180706、 180707、 180708、180709、180710，備用。

2.1.2 單味藥制劑 按復方甘草清瘍合劑制備工藝，分別制備方中各味藥的單味藥制劑，備用。

2.1.3 陰性制劑 按復方甘草清瘍合劑制備工藝，分別制備方中各味藥的陰性制劑，備用。

2.1.4 供試品溶液 精密量取上述制劑各1 mL，分別置10 mL量瓶中，加水定容，搖勻，高速離心（12 000 r／min，10 min），取上清液，經0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.1.5 對照品溶液 精密稱取甘草酸單銨鹽、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、表小檗堿、6-姜辣素對照品各1 mg，置于10 mL 量瓶中，加入適量甲醇，超聲溶解，加甲醇定容，搖勻，離心，取上清液，即得。

2.2 色譜條件 Waters XTerra C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A） -0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～6 min，19%A；6 ～55 min，19%～26%A；55 ～80 min，26%～71%A；80 ～85 min，71%～19%A；85 ～90 min，19%A）；體積流量0.8 mL／min；柱溫25 ℃；進樣量10 μL；檢測波長237 nm。

2.3 指紋圖譜參照峰 所建立的指紋圖譜中，15 號峰（后經對照品對比可知為黃芩苷） 具有最大的峰面積、適中的保留時間及穩定的峰型，因此選其為參照峰。在后續內容中，均以該峰作為參照，以計算其余峰的相對峰面積及相對保留時間。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取“2.1.5” 項下對照品溶液，在“2.2” 項條件下連續進樣6 次，測得各峰峰面積及保留時間的RSD 分別為2.154%～2.331%、0.009%～0.215%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取 “2.1.1” 項下全方制劑， 按“2.1.4” 項下方法，平行制備6 份供試品溶液，在“2.2”項條件下分別進樣，測得各共有峰峰面積及保留時間的RSD 分別為1.104%～2.153%、0.052%～0.892%，表明該方法重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗 取“2.1.4” 項下供試品溶液，在“2.2” 項條件下，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣，測得各共有峰峰面積及保留時間的RSD 分別為1.280%～1.969%、0.033%～1.069%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.5 指紋圖譜建立

2.5.1 共有模式及相似度 取10 批復方甘草清瘍合劑，按“2.1.4” 項下方法分別制備供試品溶液，在“2.2” 項條件下進樣測定，將所得色譜圖以cdf 格式保存，導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.130723 版本），以平均數法生成復方甘草清瘍合劑的指紋圖譜共有模式，見圖1～2。

圖1 10 批合劑HPLC 指紋圖譜

取10 批復方甘草清瘍合劑，按“2.1.4” 項下方法分別制備供試品溶液，在“2.2” 項條件下進樣測定，將所得色譜圖以cdf 格式保存，與共有模式一同導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.130723 版本），參照15 號峰，計算其余各峰的相對保留時間及相對峰面積；以共有模式作為參照圖譜，設其相似度1.000，計算10 批煎液的相似度，結果見表1～3。

圖2 復方甘草清瘍合劑指紋圖譜共有模式

表1 10 批合劑共有峰相對保留時間

根據上述結果可知，10 批復方甘草清瘍合劑指紋圖譜的相似度均大于0.95，圖譜中各峰的相對保留時間及相對峰面積差異亦較小，表明該方法穩定、可行，得到的復方甘草清瘍合劑指紋圖譜相似度良好。

2.5.2 共有峰歸屬 取“2.1.4” 項下各供試品溶液及“2.1.5” 項下對照品溶液，在“2.2” 項條件下分別進樣，將所得色譜圖進行對比，見圖3。結果表明，對照品溶液中各成分在全方合劑圖譜中均能出峰。除漢黃芩素及6-姜辣素外，各陰性制劑圖譜提示上述其他成分均無干擾，表明這些峰具有較好的專屬性，可作為復方甘草清瘍合劑指紋圖譜中被確認化學本質的特征峰。

表2 10 批合劑共有峰相對峰面積

表3 10 批合劑相似度

復方甘草清瘍合劑指紋圖譜中共可確定30 個共有峰，標號為1～30。組成全方的藥味中，黃芩對全方指紋圖譜的貢獻度最大，其次為黃連、甘草、干姜。30 個共有峰中，2、6、7、26、27、30 號等6 個峰來自甘草，但其中7 號峰有一定干擾；7、8、9、15、18、19、20、21、22、23、28、29 號等12 個峰來自黃芩，但7、8 號峰有一定干擾；1、3、4、7、8、10、11、12、13、14 號等9 個峰來自黃連，但7、8 號峰有一定干擾；28 號峰來自干姜，但有一定干擾。上述共有峰中，7 號峰由黃連、黃芩2 味藥疊加而成，8 號峰由甘草、黃芩、黃連3 味藥疊加而成；28 號峰由黃芩、干姜2 味藥（漢黃芩素、6-姜辣素）疊加而成，但在黃芩陰性制劑圖譜中未見28 號峰，干姜單味藥制劑圖譜中28 號峰也極小，推測是由于干姜在處方中劑量較小，且其主要有效成分易揮發，在合劑制備過程中轉移率低而導致。除7、8、28 號峰外，其余特征峰無干擾，有較好的專屬性。

在共有峰的歸屬過程中，5、16、17、24、25 號峰未能歸屬到任何一味藥中，可能是方中諸藥在合煎過程中相互作用生成了新成分。

3 討論

本實驗建立了復方甘草清瘍合劑HPLC 指紋圖譜，從中指認了30 個共有峰，并通過對照品確認了其中9 個峰的化學本質，分別為甘草酸、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、小檗堿、黃連堿、巴馬汀、表小檗堿、6-姜辣素。同時，測定了10 批復方甘草清瘍合劑的指紋圖譜，其相對保留時間及峰面積值較為穩定，相似度高，表明該方法可作為復方甘草清瘍合劑質量控制的依據。

復方甘草清瘍合劑中的主要藥味甘草、黃連、黃芩等均為常用中藥，其在復方制劑中的指紋圖譜研究也多見報道［2-8］。課題組在分析相關文獻后發現，供試品處理方法多較為繁瑣，且部分共有峰分離度不能達到滿意的效果。本研究曾比較了水稀釋液與醇沉上清液的圖譜，未見明顯差異，故最終選擇了藥液用水稀釋后直接進樣的方法，操作簡單、節省資源，且共有峰的分離度理想，為這些中藥的指紋圖譜研究提供了新思路。

圖3 各成分HPLC 色譜圖

本研究采用不同濃度的磷酸水溶液、三乙胺水溶液作為水相，結果表明0.1%磷酸水溶液有較好的洗脫能力和分離能力，尤其是對于制劑中黃芩、黃連主要成分有良好的分離效果，故最終選擇其為水相。同時比較了乙腈和甲醇2 種有機相，結果發現甲醇不能較好地對樣品進行洗脫和分離，故選擇乙腈為流動相。此外，還比較了不同柱溫、不同色譜柱對特征峰分離度的影響，最終確定使用Waters XTerra C18色譜柱，柱溫25 ℃。

本研究建立的復方甘草清瘍合劑指紋圖譜中有部分藥味沒有指認到共有峰，可能是由于這些藥（如珍珠母） 中的主要成分［9］不適宜使用該色譜條件進行測定，故該色譜條件下無法對這些藥進行質量控制，后續應嘗試采用其他方法控制其在本方中的質量。

在進行共有峰歸屬的過程中，推測5、16、17、24、25號峰可能是諸藥合煎生成的新成分，這些新成分的出現可能使中藥復方比單味中藥具有更多的藥理作用或更強的療效，體現了中藥配伍運用的合理性，這也與多數學者的研究觀點相符合［10］。

在分析復方甘草清瘍合劑的指紋圖譜時，發現與單味藥制劑相比，全方制劑中來自黃芩、黃連的共有峰峰面積有顯著下降。通過文獻分析可知［11-15］，黃芩、黃連在共煎時會產生大量絡合物沉淀，從而使來自黃芩、黃連的成分在水煎液中含有量大幅度降低。另有文獻表明，黃芩黃連共煎沉淀物的生物利用度極低16-17］，故后續可進一步研究黃芩、黃連共煎是否會降低療效及如何提高其生物利用度等。

此外，通過分析各批次指紋圖譜中共有峰的相對保留時間及相對峰面積，發現各批次間所有共有峰的相對保留時間差異都極小，但某些共有峰在各批次間的相對峰面積有較顯著的差異，這可能是不同批次的制劑所使用的原料飲片存在一定的質量差異，從而造成了這一結果。因此，后續研究可從不同產地飲片的質量入手，選擇優質原料藥，嚴格控制制劑的質量，以期獲得較佳的臨床療效。