補腎中藥對老化間充質干細胞內外微環境改變及其分化方向調控的影響

劉幸明， 趙永杰， 蔡俊笙， 王翰宇， 梁志強， 程志安*

（1.廣州中醫藥大學，廣東廣州510405；2.河南省許昌市立醫院，河南許昌461000；3.廣東省中醫院，廣東 廣州510120）

老化可使機體整體內環境發生巨大改變，也使骨髓內微環境與復雜的細胞內、外信號調控發生改變。衰老大鼠的氧化應激可能是導致年齡相關性骨丟失的重要致病機制［1］，老化使間充質干細胞更趨向于分化為脂肪細胞，而不是成骨細胞，骨量持續性減少和丟失，導致骨質疏松癥發生［2］。既往研究［3-4］表明，補腎中藥能誘導間充質干細胞成骨分化、提高抗氧化能力抑制成脂分化，但它能否通過改變細胞內外微環境起到同樣的作用尚不明確，故本實驗為此進行了研究。

1 材料

金匱腎氣丸、健骨二仙丸、六味地黃丸來源于廣東省中醫院藥學部（金匱腎氣丸由干地黃、山藥、山萸肉、澤瀉、茯苓、牡丹皮、桂枝、附子按8 ∶4 ∶4 ∶4 ∶3 ∶3 ∶1 ∶1 比例組成，健骨二仙丸由龜板、鹿角膠、黨參、枸杞子、續斷、山藥按1 ∶1 ∶3 ∶6 ∶6 ∶6 比例組成；六味地黃丸由熟地黃、山藥、山萸肉、澤瀉、茯苓、牡丹皮按8 ∶4 ∶4 ∶4 ∶3 ∶3 比例組成）。清潔級健康SD 成年大鼠40 只，體質量（200±50） g，63～70 d，雌雄各半，購自廣東省醫學實驗動物中心，動物生產許可證號SCXK（粵） 2013-0002。胎牛血清（貨號SH30087.01）、DMEM-F12 培養基（貨 號 SH30023.01B）、 DMEM-高 糖 培 養 基 （貨 號SH30022.01B）、青鏈霉素（貨號SH30010）、磷酸鉀緩沖液（貨號SH30256.01B） （美國Hyclone 公司）；cellTiter 96 AQ 單溶液細胞增殖檢測試劑（貨號G3582，美國Promega公司）；成骨誘導培養基、成脂誘導培養基（StemPro?Adipogenesis Differentiation Kit， 美 國Gibco 公 司， 貨 號A10070-01）。潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司，型號SW-CJ-IFD）；低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司，型號SC3614）；倒置光學顯微鏡（型號CKX41、U-CTR30-2，日本Olympus 公司）；細胞恒溫培養箱（美國Thermo Scientific 公司，型號HERAcell150i）；倒置熒光顯微鏡（德國Leica 公司，型號DMI6000B）。

2 方法

2.1 含藥血清制備 金匱腎氣丸、健骨二仙丸、六味地黃丸濃煎后，分別按照89.1、75.9、85.8 g／kg 劑量灌胃給藥，每天2 次，連續7 d，最后1 d 灌胃給藥后2 h 再次給藥。第2 次給藥后1 h，大鼠腹主動脈取血，離心，取上清，除菌，滅活，分裝，-80 ℃保存備用。根據前期實驗篩選出的10%含藥血清［3］，將其隨機分為空白組、模型組、健骨二仙丸組、六味地黃丸組、金匱腎氣丸組。

2.2 模型建立［5］及鑒定 10 只大鼠沖出骨髓細胞培養，每3 d 換液1 次，培養7 d，300 μmol／L H2O2處理24 h。然后，通過β-半乳糖苷酶染色鑒定，方法為固定15 min，洗滌，染色12 h，顯微鏡下觀察。

2.3 細胞增殖檢測 采用MTS 法。收集0、48 h 細胞，加入cellTiter 96 AQ 單溶液細胞增殖檢測試劑4 h 后酶標儀讀板，讀取490 nm 波長處OD 值，計算增殖率，公式為增殖率＝ （48 h 平均OD 值／0 h 平均OD 值-1） ×100% （同一樣品）。

2.4 成骨誘導、茜素紅染色及ALP 活性檢測 當各組細胞貼壁生長達到80%融合時成骨誘導，培養3 d 后再維持7 d，觀察細胞形態，檢測ALP 活性，具體檢測步驟按試劑盒說明書進行。繼續培養至14 d 后，茜素紅染色鑒定成骨細胞。

2.5 成脂誘導及油紅O 染色 成脂誘導方法同“2.4” 項下成骨誘導。培養7 d 后，油紅O 染色鑒定脂肪細胞。

2.6 相關因子檢測 經典TRIzol 提取總RNA，檢測濃度、提純、逆轉錄，rRT-qPCR 采用一步法，按照說明書進行操作，2-△△Ct法分析各基因表達差異。然后，應用Invitrogen在線引物設計軟件OligoPer-fectTM Designer 設計， 采用BLAST 進行比對，探針序列由美國Invitrogen 公司合成，根據NCBI 數據庫序列設計（CollagenΙ ID 100199754，Runx2 ID 12393，DLX5 ID 13395，OSX ID 170574，OCN ID 632，PPARγ2 ID 19016，C／EBPβ ID 12608，TAZ ID 66826），引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7 TAZ 蛋白表達檢測 采用Western blot 法。裂解→收集→調整濃度→煮沸→冷卻→電泳→轉膜→TAZ 一抗→37 ℃孵育2 h→洗膜→二抗→洗膜→轉膜→顯影。

2.8 統計學分析 通過SPSS 19.0 軟件進行處理，數據以表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 氧化模型及成骨、成脂效果鑒定 氧化后老化間充質干細胞在β-半乳糖苷酶染色陽性率明顯增加，細胞核周圍有天藍色顆粒，補腎中藥處理后陽性率明顯減少，H2O2處理后老化間充質干細胞增殖減少，而藥物處理后增加。表2、圖1 顯示，與空白組比較，模型組扁平狀、分布稀疏的老年細胞數量明顯增加；與模型組比較，成脂誘導的細胞均被油紅O 染為紅色，各補腎中藥組紅染減少，而成骨誘導后細胞均被茜素紅染為棕褐色，各補腎中藥組染色增加；模型組ALP 活性顯著低于空白組（P＜0.05），各補腎中藥組顯著高于模型組（P＜0.05）。

表2 各組對H2O2 誘導衰老細胞的影響

表2 各組對H2O2 誘導衰老細胞的影響

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別 細胞藥物敏感性增殖率／% ALP 活性空白組 10.38±0.82 1.98±0.02模型組 -42.22±0.84* 0.29±0.01*金匱腎氣丸組 22.54±0.85△ 0.69±0.14△健骨二仙丸組 23.75±0.36△ 0.87±0.22△六味地黃丸組 19.72±1.24△ 0.60±0.16△

圖1 各組細胞顯微鏡圖（×100）

3.2 成骨、成脂誘導因子mRNA 表達 表3 ～4 顯示，與空白 組 比 較， 模 型 組OCN、 Collagen Ⅰ、 DXL5、 OSX、RunX2、TAZ mRNA 表達顯著下調 （P ＜0.05），PPARγ2、C／EBPβ mRNA 表達顯著上調（P＜0.05）；與模型組比較，各補腎中藥組OCN、DXL5、OSX、RunX2、TAZ mRNA 表達顯著上調（P＜0.05），PPARγ2、C／EBPβ mRNA 表達顯著下調（P＜0.05）。

3.3 TAZ 蛋白表達 圖2 顯示，與空白組比較，模型組TAZ 蛋白表達顯著下調（P＜0.01）；與模型組比較，各補腎中藥組其蛋白表達有所上調，其中金匱腎氣丸組、六味地黃丸組差異有統計學意義（P＜0.05）。

表3 各組成骨誘導因子mRNA 表達比較

表3 各組成骨誘導因子mRNA 表達比較

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別 CollagenΙ Runx2 DLX5 OSX OCN空白組 1.00±0.21 1.00±0.08 1.00±0.10 1.00±0.06 1.00±0.17模型組 0.27±0.01* 0.13±0.01* 0.40±0.03* 0.22±0.02* 0.36±0.04*金匱腎氣丸組 0.30±0.04 0.32±0.03△ 0.90±0.02△ 0.79±0.11△ 0.53±0.05△健骨二仙丸組 0.45±0.05 0.43±0.01△ 0.52±0.11 0.55±0.01△ 0.76±0.09△六味地黃丸組 0.36±0.04 0.66±0.18△ 0.64±0.04△ 0.79±0.12△ 0.81±0.19△

表4 各組成脂誘導因子mRNA 表達比較

表4 各組成脂誘導因子mRNA 表達比較

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別 PPARγ2 C／EBPβ TAZ空白組 1.00±0.06 1.00±0.09 1.00±0.30模型組 4.28±0.27* 6.39±0.56* 0.21±0.04*金匱腎氣丸組 2.60±0.32△ 4.12±0.08△ 0.68±0.08△健骨二仙丸組 3.48±0.78△ 3.96±0.91△ 0.68±0.04△六味地黃丸組 2.96±0.50△ 3.09±0.54△ 0.87±0.05△

圖2 各組TAZ 蛋白表達

4 討論

機體衰老時，內環境氧化應激水平增高，抗氧化能力降低，導致骨質量下降，骨皮質變薄，骨髓脂肪組織增多，具有多項分化潛能的間充質干細胞特性、增殖活性、端粒酶活性、端粒長度、分化能力與方向隨之改變，一方面涉及老化所致的細胞自身內在因素改變，另一方面涉及細胞外骨髓內微環境的改變。從細胞自身來說，Runx2 為特異性成骨細胞轉錄因子和成骨細胞分化的關鍵調節因子，而OSX、Runx2 是多條信號通路的共同下游基因，可作為其下游基因啟動成骨基因［6-8］；TAZ 作為共同激活因子，可刺激Runx2 轉錄而抑制PPARγ2 轉錄，從而調節間充質干細胞向成骨細胞分化，老化使其水平下調，干細胞更趨向與脂肪分化；ALP 活性正向反映成骨細胞分化水平［9］，Ⅰ型膠原是骨細胞外基質的主要有機成分，前者表達取決于后者產生量；OCN 在成骨晚期的表達隨著細胞分化和基質礦化而增加，常作為礦化晚期的標志物使用［10］。在骨鈣素、骨涎蛋白、Ⅰ型膠原的調控序列上，均存在Dlx5 的結合位點，能促進骨基質的礦化，增強Runx2 基因P1 啟動子的活性，促進成骨分化［11］。PPARγ2 正向調節脂肪生成，是脂肪細胞形成合成通路的中心轉錄調控因子［6，12-13］。在分化早期，C／EBPβ 被活化后表達增加，隨后激活C／EBPα，協同PPARγ2 共同調控脂肪分化。本實驗表明，缺少C／EBPβ的胚胎成纖維細胞脂肪生成能力明顯減低［14］。

《素問·陰陽臟象大論》指出， “腎主骨生髓，精生髓、髓居其中，髓養骨，骨生髓，聚髓為腦”，故中醫治療骨病大多以補腎為主。有學者認為，間充質干細胞相當于中醫的“精” “髓”［15］，補腎中藥調節氧化衰老細胞內微環境，促進精血津液化生，并使之轉化為能量，促進生長，就骨骼生長發育方面而言，主要體現在促進成骨抑制成脂。課題組前期從補腎中藥中選擇補腎陰（六味地黃丸）、補腎陽（金匱腎氣丸）、補腎填精（健骨二仙丸［16］），發現其含藥血清能通過調控細胞內微環境來促進間充質干細胞增殖，增強細胞活性，抑制成脂促進成骨。

另外，補腎中藥可防止氧自由基過量產生，具有抗氧化作用［17］。氧化處理后，細胞內抗氧化系統失衡，產生大量活性氧族，使p16、p21、p53 基因表達增加而引起早衰，當有大量活性氧族在體內聚集時，可通過p53 作用使得下游靶點p21 抑制CDK／cyclin 復合體活性，并下調pRb／E2F軸，降低間充質干細胞自我更新及再生能力，促進衰老，同時p53／p21 途徑還可通過與p16／pRb 途徑相互作用來共同誘導細胞內出現早熟性衰老［18］。本實驗中β-半乳糖苷酶染色和ALP 活性檢測均顯示，氧化可使細胞衰老，下調OCN、DXL5、OSX、RunX2、TAZ 表達，上調PPARγ2、C／EBPβ mRNA 表達，促進成脂分化抑制成骨分化；補腎中藥處理后，增強了衰老細胞活性，提升OCN、DXL5、OSX、RunX2、TAZ 表 達，抑 制PPARγ2、C／EBPβ mRNA 表 達，逆轉成脂分化的趨勢，促進成骨分化。

本實驗通過氧化誘導衰老模型，驗證了補腎中藥能通過改變細胞內成骨、成脂相關因子的表達，同時調節細胞外微環境促進精血津液化生，從而促進細胞生長、成骨分化。但本實驗僅停留在大分子階段，對于更小分子（如miRNA 等） 的影響還需進一步探究。