中藥中糖類定性及定量研究進展

趙春霞， 余河水， 王春華， 李 正

（天津中醫藥大學中藥制藥工程學院，天津300193）

中藥及制劑中，小分子的脂溶性成分一直作為中藥的藥效物質基礎研究重點，而其中的單糖、寡糖以及多糖的研究成為近年來研究中藥藥效物質基礎的重要研究對象。糖類因其多樣的生物活性而受到廣泛關注，見表1，但其水溶性強，寡糖及多糖分子量大，結構難確證，成為現代中藥研究的難點。本研究綜述關于中藥中單糖、寡糖、多糖的定性以及多糖的定量分析方法等，總結近年來科研工作者對中藥中糖類成分的定性及定量研究進展，以期為中藥中糖類成分的定性和定量以及質量控制提供參考，有利于中藥物質基礎的全面研究以及中藥質量控制標準的提升。

1 定性方法

單糖是糖類物質的基本單元，通過共價鍵結合生成寡糖和多糖。單糖的分析分為游離單糖的分析和多糖中單糖的分析，但對多糖中的單糖分析時須選用合適的降解方法降解多糖后，采用適宜的方法分析單糖。單糖的分析是1種解決糖類物質結構鑒定的重要方法，是分析寡糖和多糖的重要手段［13］，它是1 種多羥基醛或酮，無熒光特性，具有很高的親水性，結構具有相似性，存在差向異構體［14］。單糖的結構導致其分析具有一定難度，近年來，已有很多方法對單糖進行定性及定量分析，如高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、薄層色譜法（TLC）、毛細管電泳法（HPCE）、核磁共振波譜法（NMR） 等。常用的單糖定性方法及優缺點見表2。

表1 主要生物活性

表2 單糖的主要定性方法及優缺點

1.1 HPLC 單糖的HPLC 分析可分為衍生化和不需衍生化兩大類，包含多樣化的分離模式（離子交換柱、親水色譜柱、反相柱） 和檢測器（用于衍生化單糖檢測的二極管陣列檢測器、質譜、紫外檢測器、熒光檢測器和脈沖安培檢測器等，用于直接檢測的蒸發光散射檢測器、示差折光檢測器）［14］。單糖幾乎無紫外吸收，也無熒光特性，可通過衍生化將其轉化成具有紫外吸收或可以產生熒光的物質后，采用色譜進行分離分析，此法可使糖類衍生物通過紫外或熒光的方法痕量檢出。液相色譜中常用的糖類物質檢測的衍生化試劑包括氨基吡啶類、酰肼類、苯胺類、氨基苯甲酸酯類熒光衍生試劑。Ding 等［15］采用1 種新型熒光試劑4-［ （氨基氧基） 甲基］ -6-氯-7-羥基香豆素（AOCC）衍生化單糖生成肟后，用2-甲基吡啶-硼烷進行還原衍生物，并采用HPLC 分析，熒光檢測器檢測，此方法可用于高精度高靈敏度和高選擇性的單糖分析，也為分析其他碳水化合物提供參考。余慧劍等［16］采用CarboPac PA10 分離柱對當歸補血湯中的單糖（阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、核糖） 和蔗糖進行分離后，用脈沖安培檢測器進行檢測，結果顯示，方法檢出限在3.8～200.5 μg／L 范圍，此方法簡單準確，分離效果好，靈敏度高，適用于當歸補血湯中單糖和蔗糖的測定。Tanaka 等［17］介紹了1 種使用常規HPLC 系統區分醛糖對映體的新方法，醛糖與L-半胱氨酸甲酯和芳基異硫氰酸酯的一系列反應產生2-（多羥基烷基） -3-（鄰甲苯基硫代氨基甲酰基） -噻唑烷-4-（R） 羧酸甲酯。反應混合物直接用HPLC 分析，在紫外檢測器250 nm 處檢測區分了醛糖的D-、L-對映異構體。見圖1。

圖1 醛糖與L-半胱氨酸甲酯和芳基異硫氰酸酯的反應

1.2 GC 氣相色譜分辨率和靈敏度較高，易與不同檢測器耦合，適用于復雜混合物的分析，GC 和GC-MS 法可用于氣體或低沸點有機物的分析，因單糖的沸點較高，需要將其衍生化處理［18］。Wang 等［19］采用正丙胺和乙酸酐衍生化單糖，用GC 對單糖衍生物進行分析，在最佳優化條件下，可同時獲得7 種中性單糖（鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖） 和2 種糖醛酸（L-葡萄糖醛酸、L-半乳糖醛酸） 的衍生物，通過GC 法可實現高準確度和高精密度的分離和檢測。但此法對酮糖和一些罕見或特殊的單糖，如果糖、古洛糖、塔羅糖、阿洛糖、芹菜糖等的分離和分析效果不理想。

1.3 離子色譜法 單糖分析一般采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法（HPAEC-PAD），近年來發展的1 種新技術，高效陰離子交換色譜串聯質譜法（HPAEC-MS） 用于單糖的分析具有簡單快速等優點。Zhang 等［20］建立了1種HPAEC-PAD 來分析酸性糖、中性糖和氨基糖，此方法對每種糖的定量限為12.5×10-3nmol，并且在很寬的范圍內具有良好的線性關系。且不需要單糖衍生化處理，適用于分析復雜的碳水化合物的單糖組成，如不同的糖胺聚糖、藻酸鹽、褐藻糖膠、聚糖等。Xu 等［21］采用高效陰離子交換色譜（HPAEC） 與電噴霧電離（ESI） 質譜（MS） 相結合法，對果膠中的單糖進行分析，并向HPAEC 柱的流出液中加入含有機溶劑的鞘液，提高了ESI-MS 對糖的靈敏度，此法可用于痕量果膠樣品中共洗脫單糖的分離和分析。

1.4 HPCE 毛細管電泳法是分析碳水化合物的可行技術，分離機制有毛細管區帶電泳 （CZE）、毛細管等速電泳（CITP）、毛細管等電聚焦 （CIEF） 等，糖分析多采用CZE；檢測器有紫外（UV） 檢測器、激光誘導熒光檢測器、電化學檢測器、MS 檢測器等，糖檢測通常使用UV 檢測器［22］。Chen 等［23］以8 種標準單糖為對照，采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP） 對標準單糖和天冬多糖水解物衍生化處理，然后在40 mmol／L 四硼酸鈉緩沖液（pH ＝10.1）中通過毛細管區帶電泳分離，并在245 nm 處通過紫外吸收檢測，結果表明，來自天冬的多糖由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸組成。這種方法簡單快速，可實現高效分離，可用于天冬的質量控制和深度研究。陳乃東等［24］采用PMP 柱前衍生化HPCE 法分析測定多糖的單糖組成，并比較了不同種源霍山石斛、銅皮石斛及野生河南石斛藥效物質基礎的相似性，結果表明，5 種石斛中共檢測出6 種單糖（木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸、核糖），不同種源的石斛樣品單糖組成及含有量明顯不同。

1.5 NMR 核磁共振技術已經廣泛應用于分析化學、生命科學、醫藥研發、材料檢測等方面，在對化合物定性、定量和結構分析等方面有著重要作用［25］。張宏利等［25］采用NMR 分析技術，鄰苯二甲酸氫鉀作為內標，對幾種果汁中的葡萄糖、蔗糖和果糖定量分析，并與HPLC 測定結果進行比較，結果表明2 種方法的測定結果無明顯差異。NMR法樣品用量較少，不需要任何處理，分析速度較快，為葡萄糖、蔗糖和果糖的分析提供了可行方法。

2 寡糖的定性方法

寡糖又稱低聚糖，由2 ～9 個單糖通過苷鍵連接而成，是生物體內1 種重要的信息類物質。許多中藥中含有寡糖，中藥寡糖具有調節免疫系統、抗腫瘤、抗抑郁、血糖調節等多種藥理作用［26］。中藥寡糖具有的重要且特殊的生物活性，引起食品、保健、醫藥等領域人員的廣泛關注和研究。目前，寡糖的常用定性方法包括TLC、HPLC、離子色譜法、HPCE。

2.1 TLC 周斌等［27］采用TLC 對巴戟天中3 種寡糖（蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃基耐斯糖） 進行定性定量分析。以正丁醇-異丙醇-水-醋酸為展開劑， （α-萘酚） -硫酸為顯色劑，烘烤溫度110 ℃，掃描波長577 nm。結果表明，此法操作簡單，重復性較好，可用于定量分析巴戟天藥材及其產品中3 種寡糖。

2.2 HPLC Tie 等［28］建立了1 種基于新型衍生化預處理（圖2） 和超高效液相色譜-高分辨串聯質譜（UPLC-HRMS）的新型低聚糖分析方法，用于快速分析淫羊藿寡糖。在溫和條件下，寡糖被2，4-雙（二乙基氨基） -6-肼基-1，3，5-三嗪衍生化后，不需要純化，可直接采用UPLC-HRMS 法分析，根據高分辨率質譜數據對52 個淫羊藿樣品的寡糖進行分析，這種方法靈敏、高效、可靠，可用于中草藥中寡糖的分析。Liang 等［29］采用親水相互作用液相色譜對澤蘭中棉子糖族寡糖進行分離、純化和定量，結果表明，澤蘭地上部分沒有低聚糖，根部的總含有量686.5 mg／g，其中棉 子 糖 66.5 mg／g、 水 蘇 糖 289.0 mg／g、 毛 蕊 花 糖212.4 mg／g、筋骨草糖118.6 mg／g，此方法有效、靈敏，可用于寡糖的分離，純化和定量。陳凌霄等［30］采用微波輔助提取法制備棉子糖系列寡糖提取物，高效液相色譜聯用電噴霧檢測器（HPLC-CAD）對不同植物中（水蘇、生地黃、車前草） 棉子糖系列寡糖（RFOs） 定性和定量，結果表明，RFOS 在水蘇和生地黃中含有量較高，車前草中含有量極低，建立的HPLC-CAD 方法有利于對RFOs 及其產品進行質量控制。

圖2 寡糖衍生過程［28］

2.3 離子色譜 陳梅蘭等［31］采用高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法（HPAEC-IPAD） 對5 種殼寡糖（聚合度DP ＝2～6） 標準樣品進行分離和檢測，建立殼寡糖的保留因子與聚合度的關系，根據建立的相關關系對未知的殼寡糖進行定性分析。結果表明，殼寡糖聚合度的對數值與其保留因子的對數值具有線性關系，利用線性回歸方程對樣品中的4 種未知殼寡糖樣品定性分析，結果為殼七糖、殼八糖、殼九糖和殼十糖。

2.4 毛細管區帶電泳法 郭懷忠等［32］建立了1 種1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）為寡糖衍生化試劑，毛細管區帶電泳分離分析中藥寡糖的方法，并應用于板藍根活性多糖的控制降解寡糖產物的分析。結果表明，板藍根寡糖組分可按照分子量分離，分離效果較好。此法操作簡單，高效，可用于中藥寡糖樣品分析。

3 多糖概述

多糖是由10 個及10 個以上的單糖分子通過糖苷鍵連接而成的結構復雜的聚合物，一般具有一級、二級、三級、四級結構。由1 種單糖組成的多糖為均多糖，2 種及以上單糖組成的多糖為雜多糖，按照多糖的性質可分為中性多糖、酸性多糖和還原糖。其分子量較大，性質與單糖和低聚糖不同。多糖無甜味、無還原性、無變旋性、有旋光性。分子量較小的多糖易溶于水，分子量較大的多糖難溶于水，不溶于高濃度乙醇。中藥中的活性多糖主要存在于菌類、藻類、根莖類藥材中。研究表明，中藥多糖具有保護血管、免疫調節、抑菌、抗腫瘤等藥理作用［33］，且不良反應小，因此廣泛應用于醫藥、食品保健等領域。

3.1 多糖定性 多糖的定性方法有近紅外光譜法、糖譜法、高效液相色譜法、核磁共振波譜法、黏度計法、多糖轉化氰醇測定法等［34］。常用的多糖定性方法及優缺點見表3。

3.1.1 近紅外光譜 近紅外光譜是在780 ～2 526 nm 波長范圍吸收光譜，由于近紅外光譜圖復雜，信號重疊嚴重，很難找出光譜圖吸收峰的歸屬直接分析樣品信息，通常需要建立模型才能進行定性和定量［35］。魯亮等［36］采集了102 組中藥提取物口服液樣品的近紅外光譜，結合多糖化學檢測結果，應用偏最小二乘法，通過考察和優化不同光譜預處理方法，得到近紅外光譜技術快速測定口服液中多糖的最佳模型。結果表明，通過近紅外光譜技術結合化學計量學方法建立口服液中多糖快速測定方法具有一定可行性。

3.1.2 糖譜法 糖譜法通過系列定位酶切技術聯用高效分子排阻色譜法（HPSEC）、高效薄層色譜法（HPTLC）、熒光輔助凝膠電泳（PACE） 等色譜分析，實現對多糖的定性分析，對中藥多糖及其產品進行質量控制。由于多糖對不同酶定位水解的響應差異和水解產物的色譜特征，實現對不同來源的多糖進行鑒別分析。PACE 適用于高聚合度的糖分析，而HPTLC 適合低聚合度糖和單糖的分析，因此將PACE 和HPTLC 組合使用可全面分析多糖的水解特征［37-38］。Wu 等［38］采用糖譜法對7 種天然蟲草和培養蟲草的多糖進行了研究和比較，經α-淀粉酶，β-葡聚糖酶和果膠酶降解后，用PACE 和HPTLC 法進行分析，獲得多糖水解產物的綜合概況和特征，結果表明天然和培養的冬蟲夏草，培養的蛹蟲草，天然蟲草中都含有1，4-α-D-葡萄糖苷、1，4-β-D-糖苷、1，4-α-D-半乳糖苷鍵，根據糖譜可區分不同種類的天然蟲草和培養蟲草，有助于深入了解冬蟲夏草不同種類的多糖結構特征，提高天然蟲草和培養蟲草多糖的質量控制。Wu 等［39］采用糖譜法對51 批次中國枸杞水溶性多糖進行研究和比較，經部分酸水解，單一和復合酶降解后，用PACE 和HPTLC 法進行分析，結果表明，中國枸杞多糖中存在β-1，3-糖苷、α-1，4-半乳糖醛酸和α-1，5-阿拉伯糖苷鍵，多糖相似性很高，基于PACE 和HPTLC 的糖譜法可作為多糖質量控制的常規方法。

3.1.3 高效液相色譜法 每個化合物具有特定的圖譜，可利用其保留值的特性，采用標準樣品的色譜圖對檢測樣品定性［34］。栗園等［40］采用異硫氰酸熒光素（FITC） 標記太子參均一多糖，高效液相色譜-熒光檢測方法對太子參均一多糖進行檢測，考察了不同溶劑、流動相、色譜柱對檢測結果的影響，確定了最佳檢測條件，結果表明，此方法準確有效，可用于檢測分析太子參均一多糖，為太子參的進一步研究提供依據。秦垂新等［41］建立了黃精多糖水解物柱前衍生HPLC 指紋圖譜，黃精多糖柱前衍生指紋圖譜標示出10 個共有峰，鑒別了7 個共有峰（D-甘露糖、D-半乳糖醛酸、L-鼠李糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-阿拉伯糖）。

表3 多糖主要定性方法及優缺點

3.2 多糖的單糖組成分析 單糖組成是多糖一級結構研究的重要內容。研究單糖組成對研究多糖的結構特征、理化性質及構效關系具有重要意義。分析時，一般需將多糖降解，目前已有的降解方法為堿水解、酸水解、酶解和電磁輻射、超聲波裂解法等［42］。單糖組成的分析方法主要包括高效液相色譜法、離子色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法、毛細管電泳法，核磁共振波譜法等。

3.2.1 高效液相色譜法 HPLC 適用于大多數糖類的單糖組成分析，具有分析速度快、重復性好等優點［42］，可分為需要柱前衍生化和不需要柱前衍生化兩大類。柱前衍生化HPLC 法是檢測多糖中單糖組成的常用方法，但需要選擇合適的分析柱以及衍生化方法，才能實現較好的分離和檢測結果。PMP 是還原性糖的衍生化試劑之一，在堿性條件下與單糖縮合成單糖-PMP 衍生物后，可用高效液相色譜法進行檢測［43］，不需柱前衍生化方法常選用氨基色譜柱等分離單糖，通過示差折光檢測器、蒸發光散射檢測器或質譜檢測器等通用檢測器進行檢測［44］。鄺婷婷等［45］用硫酸水解蔓菁多糖后，加入PMP 試劑進行衍生化，采用反相高效液相色譜法分析蔓菁多糖中單糖的衍生物，結果表明，蔓菁多糖由半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸7 種單糖組成，其物質的量之比1 ∶0.26 ∶0.54 ∶1.06 ∶0.84 ∶0.05 ∶4.17。此研究建立了1 種準確可靠的單糖分析方法，適用于蔓菁多糖中單糖組成的測定。任紅等［46］首先將銀杏葉中多糖水解成單糖，采用液相色譜法分離單糖，蒸發光散射檢測器進行檢測，建立了1 種穩定準確、重復性好的HPLC-ELSD法分析銀杏葉多糖的單糖種類及含有量，可用于銀杏葉的質量控制。

3.2.2 離子色譜法 離子色譜是用于分析陰離子和陽離子的1 種液相色譜方法，多糖水解后產生的單糖在堿性條件下可解離成帶有不同負電荷的陰離子，可采用陰離子交換柱實現分離，脈沖安培法進行檢測［47］。離子色譜-脈沖安培檢測法簡便快捷，靈敏度較高，且不需衍生化，可直接對單糖進行定性和定量。饒君鳳等［48］采用水提醇沉法提取三青葉塊根，葉子中的粗多糖，在100 ℃下用2 mmol／L 硫酸水解粗多糖后，采用CarboPac PA10 分析柱分離，脈沖安培法測定其多糖的單糖組成，結果表明，三葉青塊根和葉中多糖由巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖6 種單糖組成，葉子中還含有果糖，多糖各單糖組分的摩爾比具有一定差異。Xie 等［49］建立了1 種簡單、快速、靈敏的HPAEC-PAD 法用于測定青錢柳多糖中的單糖組成，結果表明，青錢柳多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖組成，物質的量之比1.00 ∶1.85 ∶3.26 ∶3.12 ∶0.85 ∶0.29。何連軍等［50］采用超聲輔助水浴提取多花黃精粗多糖，經硫酸水解后，用HPAECPAD 測定其多糖中單糖的組成，結果表明，不同產地的多花黃精多糖均由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖組成，此方法分離效果好，靈敏度較高，可用于多花黃精的單糖組成的分析。

3.2.3 氣相色譜法 氣相色譜法用于多糖中單糖的組成，具有靈敏度和準確度較高，所需試樣較少等優點，因此廣泛應用于多糖的研究［51］。因單糖揮發性較小，需通過衍生化增加其揮發性后用于氣相色譜分析，對于易揮發的有機物可以直接測定。梁軍等［52］采用三氟乙酸水解麻黃根多糖，將水解物經三甲基硅醚化法衍生后，用GC-MS 法對單糖組成進行分析，準確測定出麻黃根多糖中單糖的種類和組成比例，麻黃根多糖主要由阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖醛酸組成，物質的量之比7.59 ∶5.93 ∶9.94，還含有少量的半乳糖、葡萄糖、甘露糖，此方法簡單穩定，重復性較好，是1 種酸性雜多糖分析測定的有效方法。王鑫彤等［53］采用硫酸水解肉蓯蓉多糖后，用GC 法測定肉蓯蓉多糖中單糖組分，結果表明肉蓯蓉多糖的單糖組成主要有甘露糖、葡萄糖、半乳糖，物質的量之比2.01 ∶5.72 ∶2，此方法準確可靠，可用于肉蓯蓉多糖中單糖組成分析。

3.2.4 TLC 薄層色譜法用于單糖組成的分析，具有簡單、快速、成本低等優點， 是1 種有效的定性分析方法［54］，但TLC 法靈敏度較低，含有量較少的成分的斑點會比較模糊。賈偉等［51］采用三氟乙酸水解金銀花多糖后，用TLC 法對金銀花多糖的單糖組成進行初步確定，并采用鹽酸羥胺和乙酸酐制備了糖腈乙酸酯衍生物進行GC 分析，結果表明，金銀花多糖的單糖由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖及阿拉伯糖組成，物質的量之比23.6 ∶3.3 ∶1.8 ∶2.3 ∶1.0 ∶4.2，此方法的建立為金銀花多糖的進一步研究提供了參考。肖作奇等［55］采用硫酸水解矮地茶多糖后，用薄層色譜法和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化高效液相色譜法分析矮地茶多糖的單糖組成，結果2種方法都表明矮地茶多糖由葡萄糖和半乳糖組成，高效液相色譜測得葡萄糖和半乳糖物質的量之比1 ∶2.36。TLC 法具有簡單快速的優點，但是只能用于多糖中單糖組成的定性分析，不能對單糖組成進行定量分析；HPLC 法靈敏度和準確度較高，可用于多糖的單糖組成的定性與定量分析。

3.2.5 HPCE 該法具有樣品用量少、靈敏度高、分離效果好等優點，可用于多糖的單糖組成分析［56］。鄭春英等［57］采用鹽酸水解茯苓多糖，水解產物經PMP 衍生化后，用高效毛細管電泳分析，結果表明，茯苓多糖由葡萄糖、甘露糖和半乳糖組成，物質的量之比為2.657 ∶1.000 ∶2.362，此方法準確可靠、重現性較好，可用于茯苓多糖中單糖組成的分析。張暉等［58］采用三氟乙酸水解藥桑多糖后，經PMP 衍生化，HPCE 分析藥桑多糖的單糖組成，結果表明，藥桑多糖主要由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸組成，此法可用于準確快速測定藥桑多糖的單糖組成，為其他糖類的分析提供了參考。

3.2.6 NMR de Souza 等［59］探討了硫酸水解多糖的最佳條件以使多糖的糖苷鍵最大程度的水解，同時使單糖的降解最小化。最終，提出1 種普遍適用的水解多糖的方法，并采用1H-NMR 法對單糖進行定量分析，建立了1 種精確定量測定多糖單體組成的方法。

4 多糖含有量測定

多糖含有量測定方法包括比色法、滴定法、HPLC 法、光譜法等。常用的多糖含有量測定方法及優缺點見表4。

4.1 比色法 苯酚-硫酸法是多糖在硫酸作用下水解成單糖，快速脫水生成糠醛衍生物，衍生物與苯酚縮合后生成有色化合物，在一定范圍內，有色化合物的吸收值與糖濃度成線性關系，可用來測定多糖含有量。此法不易受蛋白質等物質的干擾，顯色穩定，因此在多糖含有量測定中應用較為廣泛［60］。龐逸敏等［61］采用超聲輔助提取法提取多糖，并以葡萄糖為對照品，苯酚-硫酸法對羅漢松實中的多糖進行含有量測定，結果表明，羅漢松實多糖的平均含有量4.74 mg／g，此方法操作簡單、重復性較好，具有實際利用價值。王國凱等［62］采用水提醇沉法提取馬蘭多糖，以葡萄糖為對照品，利用苯酚-硫酸法建立了簡單、可靠、重復性好的馬蘭中多糖含有量測定方法。

蒽酮-硫酸法是多糖在硫酸的作用下水解為單糖，單糖迅速脫水成糠醛或糠醛類似物，再與蒽酮縮合成藍綠色化合物。在合適的波長和一定范圍內，有色化合物的吸收值與糖濃度呈線性關系，可比色測定多糖含有量［63］。但蛋白質等物質的存在會干擾蒽酮-硫酸法對多糖含有量的測定，因此在測定前應對樣品進行預處理去除蛋白質。靳淑敏等［64］采用醇沉法提取多糖，以無水葡萄糖為對照品，蒽酮-硫酸比色法對三黃糖敏湯中的多糖進行含有量測定，結果表明，三黃糖敏湯中多糖的平均質量濃度8.6 mg／mL，該方法簡單易行，可用于三黃糖敏湯中的多糖含有量測定。

3，5-二硝基水楊酸法是在中性或堿性條件下，還原性糖與3，5-二硝基水楊酸生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，在一定范圍內，有色物質在540 nm 吸收度值與還原糖濃度呈線性關系。張文芳等［65］采用苯酚-硫酸法測定茯苓中總糖含有量，采用3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖含有量，總糖含有量與還原糖含有量之差為多糖含有量，建立了1 種準確可靠的茯苓多糖含有量測定方法。王法琴等［66］采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3，5-二硝基水楊酸法對五味子中多糖進行定量測定，并對定量結果進行比較，結果表明苯酚-硫酸法測定結果更為靈敏，準確。因此，苯酚-硫酸法是比較理想的定量測定五味子中多糖的比色方法。

4.2 滴定法 滴定法包括斐林滴定法和間接碘量法等。斐林滴定法是1 種還原滴定法，不能排除還原糖的干擾，且此方法需在沸騰狀態下滴定，易受溫度和滴定速度的影響［67］。間接碘量法是基于氧化還原反應原理的分析方法，可以定量總糖和單糖含有量，兩者之差為多糖含有量。此法在一定程度上可排除還原糖的干擾，但在操作過程中滴定速度，振搖速度等都會導致測量誤差，因此在滴定過程中應操作規范，以減小實驗誤差［68］。

4.3 HPLC 高效液相色譜是中藥質量控制的重要手段，可以測定多糖含有量及分子量分布。高效分子排阻色譜-示差折光檢測器（HPSEC-RID） 和高效分子排阻色譜-蒸發光散射檢測器（HPSEC-ELSD） 法是通過選用凝膠排斥色譜柱，以不同分子量的葡聚糖作為標準，在RID 或ELSD 檢測器中檢測樣品［69］。楊樹娟等［70］采用水提醇沉透析法制備多糖，以葡聚糖為標樣，高效凝膠滲透色譜法對庫拉索蘆薈中的多糖進行分子量和含有量測定，結果表明，此方法專屬性強、精密準確、重復性較好，可作為蘆薈多糖分子量和含有量的測定方法。Xu 等［71］采用高效凝膠滲透色譜法對鐵皮石斛中的糖類成分進行定性和定量分析，首次將HPGPC 用于天然多糖的直接定量分析， 結果表明，HPGPC 法有是1 種高效、穩定、方便的分析方法，可用于對鐵皮石斛的鑒定和質量評價。

HPSEC-RID 和HPSEC-ELSD 法需要建立相應多糖對照品的標準曲線，通過標準曲線對多糖定量。但由于多糖較為復雜，很難獲的相應多糖的對照品。因此，Cheong 等［72］建立了1 種準確且不需要多糖對照品的HPSEC-MALLS-RID多糖定量方法，此法首先通過HPSEC 分離多糖后，采用MALLS 測定多糖的相對分子質量，最后采用多糖濃度與多糖比折光指數增量值的關聯方程求算出多糖含有量，結果表明HPSEC-MALLS-RID 結合多糖通用dn／dc 值對不同多糖對照品及混合多糖對照品進行測定，回收率90.6%～98.3%，并且可以準確測定不同組分的比例。Deng 等［73］采用 HPSEC-MALLS-RID、 GC-MS、 NMR、 基 于 PACE 和HPTLC 的糖譜法對10 批霍山石斛特定多糖的進行定性和定量分析。另外，這些方法也可以用于其他藥用植物中多糖的質量控制。

4.4 光譜法 近紅外光譜技術主要是利用一定數量光譜結合方法建立模型來預測未知的樣品，已在煙草、食品、農業等多個領域得到了較廣泛應用［74-75］。康玉資等［76］建立并且優化茯苓中水溶性和堿溶性多糖的分光光度含有量測定方法，采用建立的分光光度法對90 個批次樣品中水溶性和堿溶性多糖進行含有量測定，結果表明，所建立的方法簡便快速，適用于茯苓中水溶性多糖和堿溶性多糖的質量控制。Zhang 等［77］基于近紅外光譜法，并采用苯酚-硫酸法作為參考方法，對甘草中多糖進行定量分析和預測，結果表明，近紅外光譜結合化學計量學可以有效地用于分析甘草多糖的含有量。

高光譜圖像技術具有多波段、高分辨率、圖譜合一等有優點，可對多糖含有量快速無損的檢測。陳東等［78］利用高光譜圖像采集系統獲得何首烏的高光譜圖像，基于不同波段下圖像的平均光譜反射值建立BP 神經網絡預測模型，研究何首烏中多糖和總糖含有量的檢測方法，結果表明，該研究能夠有效預測何首烏中多糖和總糖含有量，為其含有量的無損檢測提供依據。于慧春等［79］基于高光譜圖像光譜與紋理信息檢測枸杞多糖和總糖含有量，根據相關系數篩選出最適宜的特征來提高模型的預測性能，減少計算的復雜性，此研究為枸杞整體品質的快速無損檢測提供了參考。

表4 多糖主要含有量測定方法及優缺點

多糖含有量測定法除上述方法外，還有氣相色譜法、毛細管電泳法、薄層掃描法等，測定方法的適用范圍和條件不同，應根據多糖及其化學成分的性質進行選擇。中性多糖的含有量測定常采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，酸性多糖的測定常采用硫酸咔唑法和聯苯硫酸法。多糖含有量測定時應盡量排除其他水溶性成分和雜質的影響，并選用合適的對照品。苯酚-硫酸法用于測定均多糖時，以其組成糖為對照品；測定復雜雜多糖時，應盡量明確多糖組成，采用和雜多糖組成相同的混合多糖作為對照品［80］。蒽酮-硫酸法對照品不能選擇與樣品組成差異較大的作為對照；當樣品組成無法確定時，選擇DNS 法較好［81］。色譜法與滴定法和比色法相比具有更好的專一性和準確性。HPLC可用于多糖的分離純化、單糖組成分析、定量分析、相對分子量測定等，是分析糖類物質的最主要方法［82］。HPCE在蛋白質、多肽、核酸等大分子物質的分析中應用較多，而很少用于糖分析。近年來，常采用HPCE 經柱前衍生或非衍生化直接或間接的紫外檢測、熒光檢測、電極脈沖安培檢測對多糖進行分析［67］。

5 總結

糖類是中藥中普遍存在的成分，多糖的分子量較大、結構復雜、穩定性差，使多糖的定性和定量具有一定困難。多糖的生物活性不僅與其初級結構（分子量大小與分布、單糖組成、糖苷鍵連接方式、結構單元和分支度） 有關，與高級結構如鏈的空間構象及柔韌度等也有密切關系。中藥多糖具有調節機體免疫、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等生物活性，藥效顯著且不良反應較小，使多糖不斷地被開發利用，多糖的質量控制顯得更加重要。本研究對中藥中單糖、寡糖及多糖的定性以及多糖的定量分析方法進行綜述，各種定性與定量分析方法的適用條件不同，有時采用1 種方法往往達不到理想結果，多種方法聯用才能夠彌補各種方法的不足。因此在選擇分析方法時，應考慮樣品本身的物理、化學性質及使用條件，在綜合考慮實驗條件與方法的基礎上建立樣品分析的方法，使樣品糖類成分的定性定量的分析結果更加準確可靠，以期為中藥中糖類成分的質量控制提供一定的理論依據。