不同產(chǎn)地大高良姜、紅豆蔻HPLC 指紋圖譜

丘海冰， 秦華珍， 謝 鵬， 蘇善美， 柳俊輝， 尹 優(yōu)， 陳俊其， 李明芳

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧530200）

大高良姜為姜科山姜屬植物大高良姜Alpinia galanga Willd.的干燥根莖，紅豆蔻為其干燥成熟果實(shí)，即大高良姜、紅豆蔻為同基原的不同藥用部位。2 味中藥都具有溫胃散寒的功效，均用于治療胃脘冷痛。且都收載于《中華本草》［1］，同時(shí)，紅豆蔻也被收載于2015 年版《中國(guó)藥典》［2］。課題組前期研究顯示大高良姜、紅豆蔻乙酸乙酯部位均具有治療胃潰瘍寒證的作用，其作用機(jī)制相似，均與抑制炎癥因子表達(dá)、降低氧自由基反應(yīng)，抑制胃腸運(yùn)動(dòng)、減少胃酸分泌有關(guān)［3］。中藥的親緣關(guān)系、藥用部位、化學(xué)成分、藥性藥效之間存在密切關(guān)系，親緣關(guān)系相同或相近的藥物往往具有相同或者相似的化學(xué)成分，這些成分可能是支撐其藥性藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)［4］。為了解親緣關(guān)系與化學(xué)成分之間的關(guān)系，探討大高良姜、紅豆蔻乙酸乙酯部位具抗胃潰瘍寒證作用的物質(zhì)基礎(chǔ)?；谇八幮ШY選，確定乙酸乙酯部位為其藥效部位［5］， 本研究采用HPLC 法建立不同產(chǎn)地大高良姜、紅豆蔻的指紋圖譜，并通過相似性分析、 聚類分析、 主成分分析［6-10］對(duì)大高良姜、紅豆蔻乙酸乙酯部位的化學(xué)成分進(jìn)行模式識(shí)別，深入分析其共有峰，進(jìn)行基于藥效的指紋圖譜研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；SQP 型電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］；TGL-16G 超聲波清洗器（上海安亭科學(xué)儀器廠）；L600 臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 試劑 乙醇（20170413，分析純，成都市科隆 化 學(xué) 品 有 限 公 司）； 石 油 醚、 乙 酸 乙 酯（20171201、20180226，分析純，天津市富宇精細(xì)化 工 有 限 公 司）； 甲 醇、 乙 腈 ［20171201、20180118，色譜純，賽默飛世爾科技（中國(guó)） 有限公司］；冰乙酸（20160912，色譜純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；原兒茶酸（110809-201205，含有量≥99.9%）、原兒茶醛（110810-201608，含有量≥99.9%）、 香 草 酸 （110776-201503， 含 有 量≥99.8%）、蘆?。?00080-201610，含有量≥91.9%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)羥基苯甲酸（ST05300120MG，含有量≥99.2%）、對(duì)羥基苯甲醛（DST180402-710， 含 有 量≥99.0%）、 短 葉 松 素（ST37410105MG，含有量≥99.4%），均購(gòu)于上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3 藥材 大高良姜、紅豆蔻為姜科山姜屬植物大高良姜Alpinia galanga Willd.的干燥根莖和果實(shí)，購(gòu)自廣西南寧、玉林、北海等10 個(gè)不同產(chǎn)地，信息見表1。經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室田慧教授鑒定均為正品。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液 分別精密稱取200 g 大高良姜、紅豆蔻藥材粉碎成粗粉，加8 倍量85%乙醇回流提取3 次，每次2 h，過濾，收集濾液，合并3次濾液，低溫?fù)]去乙醇，再用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯部位， 濃縮至褐色浸膏， 收率分別為3.08%、7.93%，分裝保存于4 ℃冰箱備用。精密稱取50 mg 干膏，置于2 mL 量瓶中，加甲醇溶解并 定 容， 超 聲10 min， 離 心， 取 上 清 液， 經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液 稱取對(duì)照品原兒茶酸、原兒茶醛、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、蘆丁、對(duì)羥基苯甲醛、短葉松素適量，置于2 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容， 超聲10 min， 離心， 取上清液， 經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2 色譜條件 Inertsil ODS-3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A） -0.05%冰乙酸水（B），梯度洗脫（0 ～20 min，20%～25%A；20～27 min，25%～30%A；27～37 min，30%～40%A；37～65 min，40%～45%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；柱溫30 ℃；體積流量0.8 mL／min；進(jìn)樣量10 μL。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液， 在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得大高良姜、紅豆蔻各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 分別為0.063 2%～0.137 0%、0.074 7%～0.713 8%，相對(duì)峰面積RSD 分別為0.165 6%～2.105 7%、0.372 8%～2.769 2%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液， 在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，測(cè)得大高良姜、紅豆蔻各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 分別為0.138 1%～0.362 8%、0.106 0%～0.694 2%，相對(duì)峰面積RSD 分別為0.245 9%～2.095 7%、0.196 6%～2.470 1%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6 份， 按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得大高良姜、紅豆蔻各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 分別為0.034 8% ～0.458 2%、0.071 8%～0.262 2%， 相對(duì)峰面積RSD 分別為0.124 7%～1.972 0%、0.162 5%～2.197 2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

2.4.1 指紋圖譜建立 按“2.1.1” 項(xiàng)下方法分別制備10 批不同產(chǎn)地大高良姜、紅豆蔻乙酸乙酯部位供試品溶液，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，分別建立不同產(chǎn)地大高良姜、紅豆蔻乙酸乙酯部位指紋圖譜，并將色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版） 進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，分別以S1 為參照?qǐng)D譜，多點(diǎn)校正后進(jìn)行譜峰匹配，得到大高良姜、紅豆蔻乙酸乙酯部位指紋圖譜，見圖1。并生成大高良姜、紅豆蔻乙酸乙酯部位共有模式的對(duì)照?qǐng)D譜（R），分別標(biāo)定出17 個(gè)共有峰，見圖2～3。其中對(duì)羥基苯甲醛（6 號(hào)峰） 為大高良姜、紅豆蔻乙酸乙酯部位的主要成分，在10 個(gè)產(chǎn)地中均有較好的分離度，且峰形較好、峰面積較大，故選取對(duì)羥基苯甲醛作為參比峰，10 批不同產(chǎn)地大高良姜乙酸乙酯部位共有峰相對(duì)峰面積0.012 5 ～2.190 4、紅豆蔻乙酸乙酯部位共有峰相對(duì)峰面積0.013 5 ～1.910 6。

圖1 10 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of samples

圖2 大高良姜、紅豆蔻HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogran of A.galanga and Galangae Fructus

圖3 混合對(duì)照品溶液色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of mixed standaed compounds

2.4.2 相似度分析 將得到的10 批不同產(chǎn)地大高良姜、紅豆蔻乙酸乙酯部位色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版），計(jì)算相似度，兩者相似度分別為0.899～0.994、0.882～0.962。

2.5 聚類分析 將10 批不同產(chǎn)地大高良姜、紅豆蔻乙酸乙酯部位的指紋圖譜所得的共有峰峰面積原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 24.0 軟件，采用組間聯(lián)接法，Squared Euclidean distance 聚類，得到10×10 階的近似值矩陣，結(jié)果見圖4。表明10 批不同產(chǎn)地大高良姜樣品分為2 大類，其中S1、S2、S3、S4、S5、S6、S9 為一類，S7、S8、S10 為一類；而10批不同產(chǎn)地紅豆蔻樣品分為2 大類，S1、S10 為一類，S2 ～S9 為一類，結(jié)果均與相似度分析結(jié)果一致。

圖4 10 批樣品聚類樹狀圖Fig.4 Dendrograms of ten batches of samples

2.6 主成分分析 將10 批不同產(chǎn)地大高良姜、紅豆蔻樣品的共有峰峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，導(dǎo)入SPSS 24.0 軟件，進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖5。大高良姜主成分分析結(jié)果顯示，共提取出2 個(gè)主成分，第一主成分的特征值7.490， 方差貢獻(xiàn)率74.902%；第二主成分的特征值2.198，方差貢獻(xiàn)率21.981%；第三主成分的特征值0.297，方差貢獻(xiàn)率2.970%。前2 個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率已達(dá)96.883%。而紅豆蔻乙酸乙酯部位主成分分析結(jié)果顯示，只有前2 個(gè)主成分的特征值大于1，即共提取了2 個(gè)主成分， 第一主成分的特征值7.790，方差貢獻(xiàn)率77.904%；第二主成分的特征值1.366，方差貢獻(xiàn)率13.658%；第三主成分的特征值0.541，方差貢獻(xiàn)率5.408%。前2 個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率已達(dá)91.562%。

圖5 10 批樣品主成分分析圖Fig.5 PCA plot for ten batches of samples

結(jié)果表明大高良姜、紅豆蔻乙酸乙酯部位的化學(xué)成分與產(chǎn)地?zé)o明顯差異性，其結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。從因子載荷矩陣結(jié)果表可以看出兩者第一主成分均具有最大的特征值，故選取第一主成分中各峰的貢獻(xiàn)率值對(duì)其進(jìn)行分析，結(jié)果見圖6，得出大高良姜乙酸乙酯部位前5 個(gè)權(quán)重值較大，分別為10、17、6、2、16 號(hào)峰，表明此5 個(gè)峰對(duì)大高良姜質(zhì)量影響較大；同時(shí)，分析紅豆蔻乙酸乙酯部位各因子的權(quán)重值，得前5 個(gè)權(quán)重值較大，分別為5、16、17、11、6 峰，表明此5 個(gè)峰對(duì)紅豆蔻質(zhì)量影響較大。

3 討論

由于中藥化學(xué)成分的復(fù)雜性，結(jié)合前期課題實(shí)驗(yàn)結(jié)果［11］，同時(shí)為了比較同基原不同藥用部位大高良姜、紅豆蔻的親緣-化學(xué)成分關(guān)系，本研究重點(diǎn)考察了色譜柱、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相、柱溫、體積流量等因素，基于分離度、峰形、出峰數(shù)目等，最終選取“2.2” 項(xiàng)下條件。

圖6 第一主成分貢獻(xiàn)率Fig.6 Contribution rate of the first principal component

對(duì)10 批不同產(chǎn)地大高良姜、紅豆蔻建立指紋圖譜，分別標(biāo)識(shí)17 個(gè)共有峰。大高良姜相似度均大于0.899，平均相似度0.967 7，表明不同產(chǎn)地大高良姜乙酸乙酯部位的化學(xué)成分相一致，但其含有量存在明顯差異。聚類分析結(jié)果將10 批不同產(chǎn)地大高良姜分為2 大類，表明不同產(chǎn)地對(duì)大高良姜化學(xué)成分無(wú)明顯影響；主成分分析提取出2 個(gè)主成分。

10 批不同產(chǎn)地紅豆蔻相似度均大于0.882，平均相似度0.944 6，表明不同產(chǎn)地紅豆蔻成分極其相似。此外，聚類分析結(jié)果將10 批不同產(chǎn)地紅豆蔻分為2 大類，表明不同產(chǎn)地紅豆蔻質(zhì)量無(wú)明顯差異。主成分分析提取出2 個(gè)主成分。

共有模式對(duì)照?qǐng)D譜表明具有親緣關(guān)系的同基原不同藥用部位的大高良姜、紅豆蔻乙酸乙酯部位所含成分基本一致，其化學(xué)成分差異除了化學(xué)成分含有量差異外，主要表現(xiàn)在大高良姜峰13 和紅豆蔻峰12，這2 個(gè)色譜峰可能為其藥效差異的主要成分。

早期研究表明，原兒茶酸具有抗血小板凝集、降低心肌耗氧量、 抑菌、 鎮(zhèn)痛等多方面藥理活性［12］。原兒茶醛具有非常廣泛的藥理活性，包括有抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)心機(jī)、抗血栓形成、抗氧化等藥理作用［13-16］；同時(shí)具有抗敗血癥、抗病毒、抗纖維化等藥理活性［17-19］。蘆丁具有抑菌、抗炎鎮(zhèn)痛作用［20］。對(duì)羥基苯甲醛具有顯著的抗炎、抗血小板聚集作用［21-22］。這些大高良姜、紅豆蔻乙酸乙酯部位共有的成分可能為其抗胃潰瘍寒證作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。而除標(biāo)識(shí)出的7 個(gè)物質(zhì)外，大高良姜、紅豆蔻乙酸乙酯部位其他共有峰和非共有峰是什么物質(zhì)，尚未明確。下一步將通過質(zhì)譜、血清藥物化學(xué)等手段研究其共有成分和非共有成分對(duì)大高良姜、紅豆蔻乙酸乙酯部位的質(zhì)量和藥效的影響。