UPLC-ESI-MS／MS 法同時測定胡黃連中4 種環烯醚萜

王知斌， 李 凱， 高 巖， 孫延平， 孟永海， 楊炳友， 匡海學

（黑龍江中醫藥大學，教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，黑龍江中藥天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱150040）

胡黃連為玄參科植物胡黃連Picrorrhiza scrophularaeflora Pennell 的干燥根莖，發現于西藏東南部和云南西北部海拔4 400 m 以上的地區，味苦性寒，歸肝、胃、大腸經，具有退虛熱、除疳熱、清濕熱等功效［1-2］。胡黃連中主要含有環烯醚萜類、酚苷類、苯乙醇苷類，環烯醚萜類為其主要活性和特征性成分［3］，現代藥理學研究表明，胡黃連具有保肝、抗炎、抗哮喘、神經保護、免疫活性、降血糖等活性，在臨床上應用廣泛［4-9］。2015 年版《中國藥典》 規定了胡黃連苷Ⅰ和胡黃連苷Ⅱ的總含有量不得低于9%［10］，并未對其他成分做出要求。在使用HPLC 分析胡黃連中環烯醚萜類成分含有量的過程中發現，胡黃連苷Ⅰ和胡黃連苷Ⅲ的出峰時間一致二者未分離。而液質聯用技術結合了色譜對復雜樣品的高分離能力和MS 的高選擇性、高靈敏度能有效的將二者分離。目前有關胡黃連苷Ⅰ或胡黃連苷Ⅱ單一成分含有量測定的報道較多［11-12］，但關于胡黃連苷Ⅲ、獐牙菜苷的研究未見報道［13］。因此本研究建立UPLC-ESI-MS／MS 法以芍藥苷為內標物同時測定胡黃連中胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ、獐牙菜苷的含有量，以期應用到胡黃連的質量控制。

1 材料

AcquityTMUPLC 型超高液相色譜儀 （美國Waters 公司）；4000 QTRAPTM質譜儀 （美國AB Sciex 公司）；Milli-Q 超純水制備儀（美國Milipore公司）；NewClassic MF 電子分析天平（十萬分之一，美國Mettler-toledo 公司）。

22 批胡黃連藥材采購于西藏 （XZ）、 四川（SC）、云南（YN）、甘肅（GS）、北京（BJ）、安徽（AH） 等地，經黑龍江中醫藥大學中藥資源教研室蘇連杰教授鑒定為正品。胡黃連苷I、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ、獐牙菜苷對照品、內標芍藥苷（含有量≥99%） 購于南京景竹生物科學有限公司。色譜級乙腈（美國Dikama 公司）；Milli-Q 超純水（自制）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 ACTUITY UPLC? BEH Amide 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相0.1%甲酸-乙腈（8 ∶92）；體積流量0.4 mL／min；柱溫40 ℃；進樣量2 μL。

2.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）；負離子模式；多反應監測模式 （MRM）； 源噴射電壓-4 500 V； 離 子 源 溫 度 450 ℃； 霧 化 氣379.225 kPa；加熱氣379.225 kPa；全程通入氮氣。4 個化合物及內標的檢測離子對，去簇電壓（DP），碰撞能（CE），見表1。

表1 負離子模式下分析物和內標Tab.1 MRM conditions of analyte and internal standard in negative ion mode

2.3 溶液制備

2.3.1 對照品溶液 精密稱定胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ、獐牙菜苷和內標（芍藥苷）對照品適量，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成1.528 mg／mL 胡黃連苷Ⅰ、1.154 mg／mL 胡黃連苷Ⅱ、1.120 mg／mL 胡黃連苷Ⅲ、1.006 mg／mL 獐牙菜苷和1.054 mg／mL 內標對照品貯備液。再精密吸取適量各對照品貯備液，加入同一量瓶中，用甲醇稀釋定容，配制為系列混合標準溶液，各系列混合標準溶液含胡黃連苷Ⅰ（15.28、22.92、45.84、76.40、152.8、305.6 ng／mL）；胡黃連苷 Ⅱ （11.54、 17.31、 34.62、 57.70、 115.4、230.8 ng／mL）；胡黃連苷Ⅲ（11.20、16.80、33.60、56.00、112.0、224.0 ng／mL）；獐牙菜苷（10.06、15.09、30.18、 50.30、 100.6、 201.2 ng／mL）， 上述溶液均保存于4 ℃冰箱備用。

2.3.2 供試品溶液 胡黃連干燥根莖藥材粉碎（過40 目篩），精密稱取0.1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz） 30 min，待冷卻至室溫后再稱定質量，用甲醇補足減失質量，搖勻，過濾后取續濾液1 mL 于5 mL 量瓶中，加甲醇定容，取適量經12 000 r／min 離心10 min，取上清液過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.4 專屬性試驗 圖1 表明，被測定成分間分離度良好，無雜質干擾，供試品溶液中的胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ、獐牙菜苷和芍藥苷的 保 留 時 間 分 別 為1.54、 2.09、 2.03、 1.66、1.74 min，與對照品一致，比較供試品溶液和對照品的母離子、子離子質譜圖，兩者一致，表明本法專屬性良好。

圖1 各成分UPLC-ESI-MS／MS 圖譜Fig.1 UPLC-ESI-MS／MS spectra of various constituents

2.5 線性關系考察 精密吸取“2.3.1” 項下的各系列混合對照品溶液適量，再分別加入一定量的內標溶液，制得系列濃度線性工作液，取2 μL，在“2.1” “2.2” 項條件下進樣。以各分析物的色譜峰面積和內標峰面積的比值為縱坐標（Y）、以各分析物質量濃度為橫坐標（X） 進行回歸，結果見表2。表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.6 精密度試驗 取同一批次的供試品溶液，按“2.3.2” 項下方法每天制備6 份供試品溶液，連續3 d，在“2.1” “2.2” 項條件下進樣，測得胡黃連苷I、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ和獐牙菜苷含有 量 RSD 分 別 為 1.93%、 1.96%、 2.08%、2.02%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗 取同一批次的胡黃連藥材樣品，按“2.3.2” 項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1” “2.2” 項條件下進樣，測得胡黃連苷I、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ和獐牙菜苷含有量RSD 分別為3.90%、4.21%、3.09%、3.25%，表明該方法重復性良好。

2.8 穩定性試驗 取同一批次的胡黃連藥材樣品，按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h，在“2.1” “2.2” 項條件下進樣，測得胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ和獐牙菜苷峰面積RSD 分別為2.92%、3.20%、3.81%、4.15%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含有量的供試品粉末9 份，每份約0.05 g，按高、中、低分為3 組，分別精密加入一定量的混合對照品溶液，按“2.3.2” 項下方法平行制備供試品溶液， 在“2.1” “2.2” 項條件下進樣，并計算加樣回收率，結果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝9）

2.10 樣品含有量測定 取22 個不同批次樣品，分別按 “2.3.2” 下方法制備供試品溶液。 在“2.1” “2.2” 項條件下進樣，采用內標法，根據標準曲線計算22 批樣品中胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ和獐牙菜苷的含有量， 結果見表4。

表4 各成分含有量測定結果（mg／g）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg／g）

3 討論

本實驗以胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ和獐牙菜苷作為含有量測定指標，對不同產地的胡黃連含有量測定方法進行研究，包括供試品溶液制備方法、液相色譜條件選擇、含有量測定方法學驗證等，確定了胡黃連的含有量測定方法［12］。結果表明該方法簡便可行，且有較好的準確性和精密度。

本實驗首次建立了UPLC-ESI-MS／MS 法同時測定不同批次的胡黃連中胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ和獐牙菜苷的含有量。 解決了HPLC 法中胡黃連苷Ⅰ和胡黃連苷Ⅲ的分離度較差的問題。不同批次的胡黃連藥材中4 種環烯醚萜類的含有量差異較大，部分從甘肅、四川、云南、西藏等地網購的批次質量不達標，市場上的胡黃連良莠不齊。