麻杏石甘湯及其拆方對肺炎鏈球菌致肺炎小鼠的影響

張輝果， 董志巧， 王曉利， 陳團營， 田新磊

（河南省中醫院兒科，河南 鄭州450009）

肺炎鏈球菌Streptococcus pneumoniae 是引起兒童社區獲得性肺炎最常見主要的細菌病原體［1-3］，以往臨床治療以抗生素為主，但隨著耐大環內酯類、萬古霉素類細菌的出現［4］，給治療帶來了嚴峻考驗。麻杏石甘湯是《傷寒論》 經典方劑［5］，由麻黃（去節） 四兩（9 g）、杏仁（去皮尖） 五十個（9 g）、甘草（灸） 二兩（6 g）、石膏（碎、綿裹） 半斤（18 g） 組成，加減結合中醫定向透藥治療小兒支氣管肺炎療效顯著，能顯著改善肺炎喘嗽風熱犯肺證患兒臨床癥狀，優于阿奇霉素與利巴韋林聯合治療［6］，但尚無對其作用機制的研究。近年來研究發現，凋亡蛋白與肺炎小鼠肺組織炎癥、肺泡壁增厚、肺泡上皮細胞破壞、細胞浸潤等特征的變化密切相關［7-9］，故本實驗考察不含麻黃、杏仁、石膏、甘草的麻杏石甘湯拆方及其全方對肺炎鏈球菌致肺炎小鼠Bax、Bcl-2、caspase-3 凋亡蛋白表達的影響，研究該方作用機制，并初步考證其在治療肺炎鏈球菌D39 感染所致肺炎方面的臨床配伍是否科學合理。

1 材料

1.1 試藥 麻黃、杏仁、甘草、石膏均由河南省中醫院門診中藥房提供，經河南中醫藥大學生藥教研室董成明教授鑒定為正品。肺炎鏈球菌標準株（D39）購于中國醫學細菌保藏管理中心，經血平板培養18 h 后用無菌生理鹽水稀釋至6×108CFU／mL（2 麥氏單位）。頭孢羥氨芐片（清遠華能制藥有限公司，250 mg／片，國藥準字H44023670，批號171003）。兔抗小鼠Bcl-2 多抗（批號196542）、兔抗小鼠caspase-3 單抗（批號ZP4126BP26）、兔免疫球蛋白（IgG） -免疫組化試劑盒 （批號12I09 A）、兔抗小鼠Bax 單抗（批號13CM395 A）、BCA蛋白定量試劑盒、DAB 試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物 昆明種無特定病原體級（SPF） 健康小鼠320 只，雌雄各半，5 ～6 周齡， 體質量18 ～22 g，購于河南省動物實驗中心，生產許可證號SCXK （豫） 2010-0001， 動 物 質 量 合 格 證 號41003100001519。動物飼養于河南中醫藥大學動物實驗中心， 使用許可證編號SYXK （豫） 2010-0001，溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%，自由攝食進水。

1.3 儀器 SW-CJ-1F 超凈工作臺（鄭州宏朗儀器設備有限公司）；Ion GeneStudio S5 Series DNA 測序儀、低溫高速離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；DU-600 蛋白-核酸分析儀（美國Bechman 公司）； ABI 2720 型PCR 儀 （美國ABI 公司）；H-600 電子顯微鏡、H-7650 透射電鏡（日本日立公司）；IX83 倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；UC7 超薄切片（德國Leica 公司）；LCⅡ實時熒光定量PCR 儀（美國羅氏公司）；iMark 酶標儀、Experion 電泳儀、全自動凝膠分析系統（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 供試品制備

2.1.1 全方提取物 按麻杏石甘湯全方組成比例（麻黃9 g、杏仁9 g、石膏18 g、甘草6 g） 混合藥材，粉碎，過20 目篩，取210 g（5 倍處方量），8倍量蒸餾水回流提取2 次，每次3 h，濾過，合并濾液，50 ℃下減壓濃縮，干燥，即得，蒸餾水配制成生藥量1 g／mL 的溶液。提取物稱定質量，計算出膏率，HPLC 法測定麻黃堿、苦杏仁苷、甘草酸含有量，化學滴定法測定Ca2＋含有量。

2.1.2 拆方提取物 按杏仁9 g、石膏18 g、甘草6 g 的比例混合，粉碎，過20 目篩，取165 g（5倍拆方量），按“2.1.1” 項下方法處理，作為拆方Ⅰ；按麻黃9 g、石膏18 g、甘草6 g 的比例混合，粉碎，過20 目篩，取165 g（5 倍拆方量），按“2.1.1” 項下方法處理，作為拆方Ⅱ；按麻黃9 g、杏仁9 g、甘草6 g 的比例混合，粉碎，過20目篩，取120 g（5 倍拆方量），按“2.1.1” 項下方法處理，作為拆方Ⅲ；按麻黃9 g、杏仁9 g、石膏18 g 的比例混合，粉碎，過20 目篩，取180 g（5 倍拆方量），按“2.1.1” 項下方法處理，作為拆方Ⅳ。蒸餾水配制成生藥量1 g／mL 的溶液。

2.2 分組、造模及給藥 320 只小鼠適應性喂養1周后，隨機分成正常對照組、陽性對照組、模型組及麻杏石甘湯全方組、拆方Ⅰ組、拆方Ⅱ組、拆方Ⅲ組、拆方Ⅳ組，每組40 只。除正常對照組外，其余各組小鼠均在乙醚輕度麻醉下鼻內接種6×108CFU／mL肺炎鏈球菌D39 標準菌株溶液，每只0.1 mL，接種后呈45°保持30 s 以利于溶液充分吸入，連續接種3 d；正常對照組小鼠與其他組隔離飼養在同等條件下的房間，接種等量生理鹽水。接種后，觀察各組小鼠大便、體質量、活動度、進食等情況。

滴鼻造模1 h 后開始給藥，根據小鼠體質量按成人1 d 劑量折算，麻杏石甘湯全方組為5.5 g／kg，拆方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組分別為4.71、3.14、4.32、4.32 g／kg。肺炎鏈球菌感染后1 h，麻杏石甘湯全方組小鼠按臨床等效劑量的3 倍（16.5 g／kg） 灌胃 給 藥， 拆 方Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ、 Ⅳ組 小 鼠 分 別 按14.14、9.43、12.96、12.96 g／kg 劑量灌胃，每天2次；正常對照組、模型組小鼠灌胃給予等劑量生理鹽水，每天2 次，連續14 d；陽性對照組小鼠灌胃給予頭孢羥氨芐片藥液（10 mg／mL）0.15 g／kg，每天1 次，連續3 d，之后停藥4 d，2 個循環，停藥期間灌胃給予等量蒸餾水。

2.3 組織樣本采集 于給藥后的第3、7、11、14天采集（最后1 次給藥后先禁水禁食4 h，再采集）。各組隨機取10 只小鼠，雌雄各半，脫頸椎處死，取出肺臟，4%多聚甲醛固定左肺，常規石蠟包埋，連續切片，厚度5 μm，備用；右肺保存于-80 ℃冰箱中，備用。

2.4 小鼠肺組織超微結構觀察 取各組小鼠給藥第3、7、11、14 天采集的右肺樣本，取其上葉組織，2.5%戊二醛預固定，1%鋨酸固定，環氧樹脂浸透和包埋，切片，乙酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛雙層染色，透射電鏡觀察超微結構變化。

2.5 小鼠肺組織Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達檢測 取“2.3” 項下小鼠肺組織石蠟切片，免疫組化法檢測Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達，分別滴加相應一抗（1 ∶500、1 ∶300、1 ∶500），以PBS 代替一抗作為陰性對照，DAB 染色液顯色，測定平均吸光度，進行半定量分析。

然后，Western blot 法繼續檢測三者蛋白表達。稱取“2.3” 項下各組小鼠肺組織，提取總蛋白，BCA 試劑盒進行定量。各取25 μg，電泳分離，半干電轉移至PVDF 膜，5%奶粉液封閉2 h，加入相應一抗（稀釋倍數同免疫組化法），4 ℃冰箱中放置過夜，再加入相應二抗（1 ∶5 000） 孵育1 h，化學發光法顯色。以GAPDH 為內參，Quantity One軟件對蛋白條帶進行定量分析，計算各組樣品目的蛋白條帶與內參GAPDH 條帶灰度的比值，作為相對表達量。

2.6 小鼠肺組織Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA 表達檢測 實時定量PCR 法檢測Bax、 Bcl-2、caspase-3 mRNA 表達，所用引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。取各組小鼠肺組織，制成細胞懸液，提取RNA，分析其純度及完整性，質量合格后進行反轉錄，以其產物為模板，分別加入相應引物，以GAPHD 為內參進行實時定量PCR檢 測。 引 物 序 列： Bax 正 向 5′-GTGAGGATAGACGTCACACAG-3′， 反 向 5′-TATAGAGAGTGAAGTGGCACGAG-3′； Bcl-2 正 向 5′-CAGTCCTCACGCATCTCTAC-3′， 反 向 5′-AGCTCAGTCACTCTCGCGATA-3′； caspase-3 正 向5′-TCTCTAGACGTACGGGCGTGG-3′， 反 向 5′-AGAGACCGGCGGTAGAATGC-3′。

2.7 統計學分析 通過SPSS 17.0 軟件進行處理，計量資料以（） 表示，組間差異比較采用單因素方差分析，各時間點差異比較采用重復測量數據方差分析。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠肺臟超微結構 圖1 顯示，正常對照組小鼠肺泡壁完整，游離面可見少量微絨毛，細胞胞質均勻，核膜完整；模型組小鼠細胞膜膨出，異染色體凝聚在膨出的細胞膜周邊，Ⅱ型肺泡細胞突起膨大，出現凋亡特征；麻杏石甘湯全方組小鼠Ⅱ型肺泡細胞形態較正常，細胞板層小體增多，異質染色體聚集，肺泡細胞表面有微絨毛存在，可見脫落，間質內可見膠原纖維少許；拆方Ⅰ組小鼠Ⅱ型肺泡細胞減少，細胞核凸起，細胞核內異質染色體聚集為粗塊，細胞表面有少許微絨毛存在，血管腫脹，可見細胞間堆積質膠原纖維；拆方Ⅱ組小鼠Ⅱ型肺泡細胞減少，細胞核形狀規則，染色質聚集，板層小體數量減少，肺泡之間間隔較小，有少許細胞微絨毛存在，有大量的血管腫脹可見；拆方Ⅲ組小鼠Ⅱ型肺泡細胞減少較多，細胞核凸起嚴重，染色質聚集成塊，板層小體數量減少較多，肺泡之間有一定間隔，有微量細胞微絨毛存在，血管腫脹清晰可見；拆方Ⅳ組小鼠Ⅱ型肺泡細胞急劇減少，細胞核凸起變形，染色質聚集成團塊，板層小體數量大量減少，肺泡之間間隔較大，細胞微絨毛不易察覺，血管腫脹嚴重；陽性對照組小鼠Ⅱ型肺泡細胞有所增多，細胞核及其核仁外形均完整，Ⅱ型肺泡細胞內板層小體的形態規整，細胞游離面微絨毛較豐富，細胞間質內有膠原纖維可見。

圖1 各組小鼠肺組織超微結構變化Fig.1 Ultrastructure changes of mouse lung tissues in various groups

3.2 Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達 首先，采用免疫組化法進行檢測。表1 顯示，與正常對照組比較，模型組Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達極顯著升高（P＜0.01），在不同時間點的差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，麻杏石甘湯全方組第3 天三者蛋白表達顯著降低（P＜0.05），第7天Bax、 Bcl-2 蛋白表達顯著降低 （P ＜0.05），caspase-3 蛋白表達極顯著降低（P＜0.01），第11、14 天三者蛋白表達極顯著降低（P＜0.01）；拆方Ⅰ組各時間點三者蛋白表達無顯著差異 （P ＞0.05）；拆方Ⅱ組第7、11、14 天Bax 蛋白表達顯著降低（P＜0.05），第14 天Bcl-2 蛋白表達顯著降低（P＜0.05），第11、14 天caspase-3 蛋白表達顯著降低 （P ＜0.05）； 拆方Ⅲ組各時間點Bax、caspase-3 蛋白表達無顯著差異（P＞0.05），第7、11、14 天Bcl-2 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；拆方Ⅳ組各時間點Bax、Bcl-2 蛋白表達顯著降低（P＜0.05），第11、14 天caspase-3 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達比較（免疫組化，n＝10）Tab.1 Comparison of Bax，Bcl-2 and caspase-3 protein expressions among various groups（immunohistochemistry，，n＝10）

表1 各組Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達比較（免疫組化，n＝10）Tab.1 Comparison of Bax，Bcl-2 and caspase-3 protein expressions among various groups（immunohistochemistry，，n＝10）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與麻杏石甘湯全方組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1） 時間 Bax Bcl-2 Caspase-3正常對照組 — 第3 天 0.163±0.003 0.178±0.004 0.174±0.001第7 天 0.165±0.004 0.177±0.003 0.175±0.002第11 天 0.164±0.003 0.178±0.004 0.174±0.001第14 天 0.167±0.004 0.176±0.003 0.174±0.002模型組 — 第3 天 0.196±0.005** 0.204±0.003** 0.199±0.002**第7 天 0.197±0.006** 0.202±0.003** 0.198±0.001**第11 天 0.195±0.005** 0.203±0.002** 0.199±0.002**第14 天 0.194±0.004** 0.202±0.002** 0.199±0.001**麻杏石甘湯全方組 16.5 第3 天 0.184±0.003△ 0.185±0.002△ 0.186±0.002△第7 天 0.181±0.004△ 0.184±0.002△ 0.175±0.001△△第11 天 0.175±0.003△△ 0.175±0.003△△ 0.176±0.002△△第14 天 0.175±0.004△△ 0.174±0.002△△ 0.175±0.001△△麻杏石甘湯拆方Ⅰ組 14.14 第3 天 0.192±0.006＃ 0.201±0.002＃＃ 0.197±0.002第7 天 0.191±0.005＃ 0.201±0.001＃＃ 0.196±0.003＃第11 天 0.191±0.005＃＃ 0.199±0.002＃＃ 0.196±0.002＃＃第14 天 0.190±0.006＃＃ 0.198±0.001＃＃ 0.195±0.003＃＃麻杏石甘湯拆方Ⅱ組 9.43 第3 天 0.186±0.003 0.196±0.001＃ 0.193±0.002＃第7 天 0.185±0.004△ 0.195±0.001＃ 0.190±0.001＃＃第11 天 0.184±0.005△＃ 0.193±0.001＃＃ 0.183±0.003△＃第14 天 0.185±0.003△＃ 0.192±0.000△＃＃ 0.181±0.001△＃麻杏石甘湯拆方Ⅲ組 12.96 第3 天 0.188±0.005 0.194±0.002＃ 0.194±0.002＃第7 天 0.187±0.004 0.191±0.001△＃ 0.191±0.001＃＃第11 天 0.187±0.005＃ 0.187±0.001△＃ 0.189±0.003＃＃第14 天 0.186±0.004＃ 0.188±0.002△＃ 0.190±0.002＃＃麻杏石甘湯拆方Ⅳ組 12.96 第3 天 0.184±0.005△ 0.190±0.002△＃ 0.191±0.001＃第7 天 0.182±0.004△ 0.192±0.001△＃ 0.190±0.002＃＃第11 天 0.178±0.003△ 0.187±0.001△＃ 0.185±0.001△＃第14 天 0.178±0.004△ 0.186±0.001△＃ 0.182±0.002△＃陽性對照組 0.15 第3 天 0.185±0.003△ 0.188±0.002△ 0.183±0.002△第7 天 0.169±0.004△△＃ 0.179±0.001△△ 0.177±0.001△△第11 天 0.168±0.003△△＃ 0.176±0.002△△ 0.176±0.003△△第14 天 0.168±0.003△△＃ 0.176±0.001△△ 0.176±0.002△△

然后，采用Western blot 法進行檢測第7 天肺組織蛋白表達。表2 顯示，與正常對照組比較，模型組Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達極顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，麻杏石甘湯全方組三者蛋白表達極顯著降低（P＜0.01），拆方Ⅱ組、Ⅳ組三者蛋白表達顯著降低（P＜0.05），拆方Ⅲ組Bcl-2 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。與全方組比較，拆方Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組Bax、caspase-3蛋白表達極顯著升高（P＜0.01）；Ⅲ組、Ⅳ組Bcl-2 蛋白表達極顯著升高（P＜0.01），而Ⅰ組、Ⅱ組其蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。

表2 各組Bax、Bcl-2、caspase-3、Bcl-2／Bax 蛋白表達比較（Western blot，，n＝10）Tab.2 Comparison of Bax，Bcl-2，caspase-3 and Bcl-2／Bax protein expressions among various groups（Western blot，n＝10）

表2 各組Bax、Bcl-2、caspase-3、Bcl-2／Bax 蛋白表達比較（Western blot，，n＝10）Tab.2 Comparison of Bax，Bcl-2，caspase-3 and Bcl-2／Bax protein expressions among various groups（Western blot，n＝10）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與麻杏石甘湯全方組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1） Bax Bcl-2 caspase-3 Bcl-2／Bax正常對照組 — 0.61±0.04 0.76±0.05 0.68±0.04 1.25±0.06模型組 — 1.21±0.06** 1.03±0.07** 1.19±0.05** 0.85±0.04**麻杏石甘湯全方組 16.5 0.57±0.04△△ 0.75±0.06△△ 0.62±0.05△△ 1.32±0.06△△麻杏石甘湯拆方Ⅰ組 14.14 1.16±0.05＃＃ 0.94±0.06＃ 1.13±0.04＃＃ 0.81±0.05＃＃麻杏石甘湯拆方Ⅱ組 9.43 1.03±0.04△＃＃ 0.86±0.05△＃ 0.91±0.05△＃＃ 0.83±0.05＃＃麻杏石甘湯拆方Ⅲ組 12.96 1.05±0.06＃＃ 1.01±0.06△＃＃ 1.02±0.04＃＃ 0.96±0.05△＃＃麻杏石甘湯拆方Ⅳ組 12.96 0.93±0.05△＃＃ 0.95±0.04△＃＃ 0.89±0.04△＃＃ 1.03±0.05△△＃陽性對照組 0.15 0.53±0.04△△ 0.69±0.04△△ 0.58±0.03△△ 1.30±0.04△△

綜上所述，麻杏石甘湯全方組可極顯著下調Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達（P＜0.01），而各拆方組的調節作用明顯較弱，依次為Ⅳ＞Ⅱ＞Ⅲ＞Ⅰ。由此推定，麻杏石甘湯中4 味藥材在方中的作用程度依次為麻黃＞石膏＞杏仁＞甘草。

3.3 Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA 表達 表3 顯示，與正常對照組比較， 模型組Bax、 caspase-3 mRNA 表達極顯著升高（P ＜0.01），Bcl-2 mRNA表達極顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，麻杏石甘湯全方組第7 天Bax、caspase-3 mRNA 表達極顯著降低（P＜0.01），Bcl-2 mRNA 表達極顯著升高（P＜0.01），第11、14 天Bax、caspase-3 mRNA表達極顯著降低（P＜0.01），Bcl-2 mRNA 表達極顯著升高 （P ＜0.01）； 拆方Ⅳ組第7 天Bax、caspase-3 mRNA 表達極顯著降低（P＜0.01），Bcl-2 mRNA 表達極顯著升高（P＜0.01）；拆方Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組各時間點三者mRNA 表達無顯著差異（P＞0.05）。

表3 各組Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA 表達比較（n＝10）Tab.3 Comparison of Bax，Bcl-2 and caspase-3 mRMA expressions among various groups（n＝10）

表3 各組Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA 表達比較（n＝10）Tab.3 Comparison of Bax，Bcl-2 and caspase-3 mRMA expressions among various groups（n＝10）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與麻杏石甘湯全方組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1） 時間 caspase-3 Bcl-2 Bax正常對照組 — 第3 天 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00第7 天 0.99±0.02 1.01±0.01 1.00±0.02第11 天 1.01±0.01 1.00±0.02 1.01±0.01第14 天 1.00±0.01 0.98±0.03 0.99±0.02模型組 — 第3 天 7.31±0.11** 4.61±0.07** 6.12±0.11**第7 天 7.84±0.12** 4.42±0.08** 6.14±0.12**第11 天 7.53±0.10** 4.43±0.08** 6.17±0.15**第14 天 7.46±0.09** 4.45±0.09** 6.15±0.12**麻杏石甘湯全方組 16.5 第3 天 6.17±0.07 3.53±0.11 5.36±0.12第7 天 4.44±0.06△ 1.57±0.08△ 1.67±0.05△△第11 天 3.79±0.05△△ 1.37±0.07△△ 1.62±0.04△△第14 天 3.52±0.05△△ 1.24±0.06△△ 1.61±0.06△△麻杏石甘湯拆方Ⅰ組 14.14 第3 天 7.13±0.13＃ 4.13±0.10＃ 5.64±0.13第7 天 7.02±0.10＃ 4.29±0.11＃＃ 5.28±0.12＃＃第11 天 6.84±0.08＃＃ 4.33±0.12＃＃ 5.35±0.12＃＃第14 天 6.69±0.09＃＃ 4.36±0.14＃＃ 5.42±0.14＃＃麻杏石甘湯拆方Ⅱ組 9.43 第3 天 7.05±0.12 4.01±0.11＃ 4.68±0.11＃第7 天 6.76±0.13△ 4.12±0.11＃ 4.36±0.09＃＃第11 天 6.41±0.13△＃＃ 4.21±0.12＃＃ 4.27±0.13△＃＃第14 天 6.46±0.14△＃＃ 4.24±0.10△＃＃ 4.28±0.11△＃＃麻杏石甘湯拆方Ⅲ組 12.96 第3 天 7.08±0.12 3.52±0.08＃ 5.35±0.12第7 天 6.95±0.14＃＃ 2.91±0.07△＃＃ 5.21±0.12＃＃第11 天 6.68±0.14＃＃ 2.95±0.09△＃＃ 5.12±0.11＃＃第14 天 6.54±0.15＃＃ 2.98±008△＃＃ 5.14±0.10＃＃麻杏石甘湯拆方Ⅳ組 12.96 第3 天 7.01±0.005 2.22±0.07△＃ 3.66±0.07△△＃第7 天 6.39±0.004△ 2.53±0.09△＃ 3.32±0.09△△＃＃第11 天 5.84±0.003△＃ 2.74±0.06△＃ 3.29±0.08△△＃第14 天 5.61±0.004△＃ 2.76±0.10△＃ 3.41±0.10△△＃陽性對照組 0.15 第3 天 5.49±0.003△＃ 1.34±0.05△△＃＃ 1.67±0.09△△＃＃第7 天 5.07±0.004△△＃ 1.63±0.08△△ 1.33±0.06△△第11 天 4.73±0.003△△＃ 1.71±0.09△△＃ 1.34±0.07△△第14 天 4.67±0.003△△＃ 1.82±0.09△△＃ 1.33±0.08△△

4 討論

肺炎鏈球菌是引起肺炎的首要病原菌［10］，而小兒肺炎是臨床上常見的呼吸系統疾病，嚴重時伴有心力衰竭、呼吸衰竭等感染并發癥， 危及生命［11］，該細菌引起肺炎感染后，可直接或間接誘導體內細胞凋亡，也可能是生物機體利用細胞凋亡的方式清除病原微生物，是一種犧牲少數細胞而保護機體的重要防衛機制［12］。

凋亡主要受細胞內凋亡蛋白的調控，機體內調節細胞凋亡的蛋白分為抗凋亡蛋、促凋亡兩類，Bax、Bcl-2 為同源相關蛋白，其水平與細胞凋亡調控密切相關，其中前者為促凋亡蛋白，后者為抗凋亡蛋白，并且Bcl-2／Bax 異二聚體也起到抗凋亡作用。兩者在正常細胞內的比例相對恒定，但當細胞受到外界凋亡信號刺激后，各蛋白表達發生變化，從而影響細胞周期［13］。caspase-3 是caspase 家族中最重要的效應型，其表達與肺炎小鼠肺泡上皮細胞凋亡有關，也是細胞凋亡的執行者，文獻［14］報道支原體肺炎與caspase-3 蛋白表達關系密切。

本實驗發現，小鼠感染肺炎鏈球菌后肺泡上皮細胞遭到破壞，細胞有增生情況，血管及毛細血管內皮細胞有腫脹向管腔突出，肺泡細胞核質脫落，板層小體排空，空泡化，有凋亡特征結構特征發生，肺組織中Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達明顯升高，而Bcl-2／Bax 下降明顯；與模型組比較，麻杏石甘湯全方組、拆方Ⅱ組、拆方Ⅳ組Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達均有所下降，以全方組更明顯，而且Bax、 caspase-3 mRNA 表達明顯降低，Bcl-2 mRNA 表達明顯升高。

另外，對麻杏石甘湯拆方進行研究時發現，各藥材作用強度由大到小依次為麻黃、石膏、杏仁、甘草，方中麻黃為君藥，開瀉肺熱，取“火郁發之” 之意；石膏味辛、甘，性大寒，清瀉肺熱；杏仁降肺氣，佐麻黃、石膏清肺平喘；炙甘草益氣和中，調和諸藥［15］。由此推測，這些清除肺熱的藥材在麻杏石甘湯治療肺炎鏈球菌所致肺炎小鼠中可能起到了主要作用。