艾葉揮發油對A549 細胞的抑制作用

丁圓平， 劉靖怡， 田 洋， 李艷麗， 吳明哲， 趙志鴻

［1.鄭州大學藥物研究院，河南 鄭州450001；2.中國礦業大學（北京） 化學與環境工程學院，北京100083；3.鄭州大學第一附屬醫院，河南 鄭州450052；4.河南省（鄭州大學） 醫藥科學研究院，河南鄭州450052］

肺癌是目前發病率、死亡率增長最快的惡性腫瘤［1］，大多數情況下由于癌細胞高侵襲性，手術無法達到預期效果，而化療通常會產生嚴重的副作用，并且近年來新型靶向藥物價格昂貴，大大限制了臨床推廣。前期報道［2-4］，中成藥毒副反應少，對中晚期肺癌患者具有提高機體免疫力、改善臨床癥狀等作用，正成為當前研究熱點。

艾葉為菊科植物艾Artemisia argyi Lévl.et Vant.的干燥葉，具有抗炎、抗菌、抗病毒、鎮咳平喘等多種藥理作用［5-8］，廣泛應用于臨床，其主要有效成分為艾葉揮發油，前期證實它具有抗HBV、抗肝癌活性［9-10］，但尚無其抗肺癌作用的報道。因此，本實驗研究艾葉揮發油體內外抗肺癌A549 細胞活性，并初步探討其作用機制，為相關抗腫瘤新藥研發提供依據。

1 材料

1.1 試藥 艾葉產自河南駐馬店，經河南中醫藥大學董誠明教授鑒定為正品，其揮發油為實驗室自提。RPMI 1640（北京索萊寶科技有限公司）；胎牛血清、MTT（美國Sigma 公司）；AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；5-氟尿嘧啶注射液（上海旭東海普藥業有限公司）。

1.2 儀器 IL-161CT CO2培養箱［施都凱儀器設備（上海） 有限公司］；168-1000XC 酶標儀（美國Bio-Rad 公司）； XL-MCL 流式細胞儀 （美國Beckman Coulter 公司）。

1.3 動物 SPF 級雌性BALB／c-nu 裸鼠，周齡5～6周，體質量18～20 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供， 合格證號SCXK （京）2016-0006，在溫度20 ～25 ℃、相對濕度40%～60%的無菌籠中飼養，定期喂食。

2 方法

2.1 揮發油提取 稱取艾葉500 g，粉碎后置于10 000 mL 圓底燒瓶中，加入5 000 mL 蒸餾水浸泡過夜，水蒸氣蒸餾法提取6 h，收集揮發油，無水硫酸鈉除水后密封貯存于-20 ℃下，測得揮發油產率為0.39%。

2.2 細胞培養 A549 細胞貼壁生長，RPMI 1640、胎牛血清以9 ∶1 比例配制成完全培養基，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養，取對數生長期細胞進行實驗。

2.3 供試品溶液制備 1 mL 揮發油質量為944 mg。體外藥效實驗中，取揮發油16 μL，加入24 μL DMSO 混合均勻，培養基逐步稀釋，即得（DMSO 最高含有量為0.1%）；體內藥效實驗中，取揮發油1 mL，加入20 μL 吐溫-80，混合均勻，生理鹽水逐步稀釋，即得。

2.4 揮發油對A549 細胞增殖影響 胰酶消化處于對數生長期的A549 細胞，離心，調節細胞密度至5×104～6×104／mL，按每孔100 μL 接種于96 孔板中，37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h，吸去原培 養 基， 加 入 188.8、 283.2、 377.6、 472.0、566.4、660.8 μg／mL 揮發油， 陽性對照組加入10 μg／mL 5-氟尿嘧啶，陰性對照組加入100 μL 空白培養基，每個質量濃度4 個復孔。于24、48、72 h 各加入20 μL MTT 溶液，置于培養箱中孵育4 h，吸去原培養基，加入150 μL DMSO，微量振蕩器上振蕩10 min 后上機檢測，計算細胞增殖抑制率，增殖抑制率＝ （1-給藥孔吸光度／空白孔吸光度） ×100%［11］， 重 復3 次， SPSS 軟 件 計 算IC50值。

2.5 細胞凋亡率檢測 采用Annerxin V-FITC／PI雙染法。胰酶消化處于對數生長期的A549 細胞，離心，調節細胞密度至1×105／mL，按每孔2 mL 接種于6 孔板中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，吸去原培養基，加入188.8、236.0、283.2、330.4、377.6、424.8 μg／mL 揮發油培養48 h，不含EDTA 的胰酶消化收集細胞，PBS 緩沖液洗滌2次，加入Annerxin V-FITC、PI 各5 μL，流式細胞儀檢測細胞凋亡，重復3 次。

2.6 細胞周期檢測 采用PI 單染法。胰酶消化處于對數生長期的A549 細胞，離心，調節細胞密度至1×105／mL， 按每孔2 mL 接種于6 孔板中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，吸去原培養基，加入188.8、236.0、283.2、330.4 μg／mL 揮發油培養48 h，胰酶消化收集細胞，PBS 緩沖液洗滌1 次，70%冷乙醇固定，4 ℃下過夜，PBS 緩沖液洗去固定液，加入PI／RNase A 后室溫下避光30 min，流式細胞儀檢測細胞周期，重復3 次。

2.7 艾葉揮發油對A549 荷瘤裸鼠腫瘤生長及體質量的影響 裸鼠右背部皮下注射1×107個A549細胞（0.2 mL／只），建立肺癌模型，當腫瘤體積增加到約100 mm3時隨機分為5 組，每組5 只，實驗組（3 組） 分別腹腔注射230、115、57.5 mg／kg揮發油，陽性組給予5-氟尿嘧啶（10 mg／kg），對照組給予等量生理鹽水，連續15 d，每2 d 測量1次腫瘤體積和體質量。第15 天，裸鼠稱定質量，測量腫瘤體積后處死，稱定瘤重，計算腫瘤生長抑制率，公式為體積＝1／2×a×b2（a、b 分別表示腫瘤長徑、短徑）、抑制率＝ ［ （陰性對照組平均瘤重-實驗組平均瘤重） ／陰性對照組平均瘤重］ ×100%［12］。

2.8 病理組織切片 每組隨機取2 只裸鼠，剖離組織器官，生理鹽水清洗表面，吸水紙吸干水分，4%甲醛固定，HE 染色法制備病理組織切片，顯微鏡下觀察、拍照。

3 結果

3.1 揮發油對A549 細胞增殖影響 圖1 顯示，揮發油對A549 細胞增殖具有明顯的抑制作用，并呈濃度依賴性。當其質量濃度為660.8 μg／mL 時，48、72 h 細胞生長抑制率均在80%以上，24、48、72 h的IC50值分別為513.54、495.60、484.27 μg／mL。

圖1 揮發油對A549 細胞抑制率的影響Fig.1 Effect of volatile oils on the inhibition rate of A549 cells

3.2 揮發油對A549 細胞凋亡的影響 圖2～3 顯示，揮發油作用A549 細胞48 h 后隨著其質量濃度增加，細胞凋亡率也逐漸升高。188.8 ～330.4 μg／mL 時，細胞早期凋亡率無明顯變化； 繼續增加至377.6 μg／mL時，早期凋亡率驟增；424.8 μg／mL時凋亡率最高，為67.1%。

3.3 揮發油對A549 細胞周期的影響 圖4 ～5 顯示，揮發油作用于A549 細胞48 h 后，G0／G1 期細胞比例降低，G2／M 期無明顯變化，S 期細胞比例增加。隨著其質量濃度增加，S 期細胞比例逐漸增加，具有濃度依賴性。

3.4 揮發油對腫瘤生長的影響 表1、圖6 ～8 顯示，230、115、57.5 mg／kg 揮發油的抑瘤率分別為55.54%、33.85%、19.20%，低于5-氟尿嘧啶組的71.10%，但連續給藥5 d 后，5-氟尿嘧啶組裸鼠出現食欲不振、體質量明顯下降的現象；揮發油組無明顯變化，并較陰性對照組能明顯抑制腫瘤生長。

圖3 A549 細胞凋亡曲線Fig.3 Apoptosis curves for A549 cells

表1 各組腫瘤質量、抑瘤率的比較Tab.1 Comparison of tumor weights and tumor inhibition rates among various groups

表1 各組腫瘤質量、抑瘤率的比較Tab.1 Comparison of tumor weights and tumor inhibition rates among various groups

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 （m劑g·量kg／-1） 腫瘤質量／g 抑瘤率／%陰性對照組 — 2.22±0.36 —艾葉揮發油組 230 0.99±0.08** 55.54艾葉揮發油組 115 1.47±0.10* 33.85艾葉揮發油組 57.5 1.79±0.21* 19.20 5-氟尿嘧啶組 10 0.64±0.06** 71.10

圖4 各組A549 細胞48 h 周期分布（Ⅰ）Fig.4 Cycle distributions of A549 cells at 48 h in various groups（Ⅰ）

圖5 各組A549 細胞48 h 周期分布（Ⅱ）Fig.5 Cycle distributions of A549 cells at 48 h in various groups（Ⅱ）

圖6 各組裸鼠腫瘤體積Fig.6 Tumor volumes of nude mice in various groups

圖7 裸鼠腫瘤體積變化曲線Fig.7 Variation curves for tumor volumes of nude mice

圖8 裸鼠體質量變化曲線Fig.8 Variation curves for body weights of nude mice

3.5 病理組織分析 圖9 顯示，陰性組裸鼠腫瘤細胞排列紊亂緊密，片塊狀彌散分布，細胞胞漿豐富，細胞核增大，深染，具有明顯的異型性；5-氟尿嘧啶組裸鼠腫瘤組織出現明顯局灶性壞死，腫瘤細胞核分裂相減少，核固縮、碎裂、溶解，出現大片壞死；艾葉揮發油低劑量組裸鼠腫瘤細胞細胞排列緊密，部分出現萎縮，細胞界限模糊，未呈現典型凋亡狀態；艾葉揮發油高劑量組裸鼠腫瘤細胞體積減小，細胞間隙增大，核漿比例縮小，細胞胞核染色變淺，核分裂相減少，出現大量凋亡小體，呈現凋亡狀態。與陰性對照組比較，5-氟尿嘧啶組裸鼠肺泡壁明顯增生變厚，而艾葉揮發油組無明顯變化，但出現肺大泡，表明肺部組織發生了病理變化；5-氟尿嘧啶組、艾葉揮發油高劑量組裸鼠肝組織切片中均出現細微裂縫，表明也有部分病變；各組裸鼠心、脾、腎組織HE 病理組織切片顯示，各組織內細胞結構緊湊，界限清晰，均未見明顯病理學病變和轉移瘤灶。

圖9 各組裸鼠組織病理學切片Fig.9 Histopathological sections of nude mice in various groups

4 討論

肺癌具有惡化程度高、治療效果差、早期癥狀體征不典型等特點，化療是最常用的方法，但其自身毒副作用和耐藥性又妨礙臨床療效［13-14］，臨床常見的類型是非小細胞肺癌，其中肺腺癌所占比例最大。A549 細胞屬于人肺腺癌細胞系，細胞學水平實驗中常被作為標準模式細胞［15］。

艾葉揮發油為小分子物質，能被機體快速吸收，成分復雜，具有多種藥理作用，故應用廣泛，如呼吸系統、抗菌、抗炎、抗腫瘤等［16-18］。本實驗首次發現，艾葉揮發油能明顯抑制體外培養人肺癌A549 細胞生長，并呈劑量-時間依賴關系；可通過抑制DNA 合成來使細胞阻滯于S 期，可能是誘導A549 細胞凋亡的機制之一；對裸鼠皮下接種的A549 細胞生長具有抑制作用，其機制可能為誘導A549 細胞凋亡。

在本實驗所測濃度范圍內，艾葉揮發油抗腫瘤活性雖不如5-氟尿嘧啶，但其對正常細胞毒性較低，而且與陰性對照組相比能明顯抑制人肺癌A549 細胞生長速度。故綜合考慮，該成分體現出了安全有效、低毒的優勢，具有廣闊的開發前景，為肺癌治療提供了新選擇。