HPLC 法同時測定藿砂顆粒中7 種成分

潘艷琳， 程心玲， 肖 淋， 翁淑琴， 卓 實， 肖 欽

（福建中醫藥大學附屬人民醫院藥學部，福建 福州350004）

藿砂顆粒由福建中醫藥大學附屬人民醫院院內制劑藿砂口服液改進劑型而來，是廣藿香、厚樸、澤瀉、茯苓等9 味中藥材組成的中藥復方制劑，具有健脾化濕、和胃止瀉的功效，臨床上主要用于脾胃不和、脘腹脹痛、嘔吐瀉泄等病癥的治療。方中廣藿香味辛性微溫，化脾胃濕滯、避穢和中，砂仁味辛性溫，溫脾止瀉，化濕開胃，兩者合為君藥；厚樸、陳皮理氣燥濕，蒼術燥濕健脾，合為臣藥；茯苓、澤瀉淡滲利濕，神曲和胃消食，合為佐藥；甘草調和諸藥，為使藥，對痞滿證、寒濕型腸易激綜合征等治療效果明顯［1-5］，但僅檢索到臣藥蒼術中茅術醇、β-桉葉醇含有量測定的報道［6-7］，未涉及君藥和其他成分。

中藥復方制劑發揮療效往往是多成分協同作用的結果，僅測定單一藥味難以有效地控制其質量均一性和療效一致性。為了全面控制和提高藿砂顆粒內在質量，參考中藥質量標志物確定原則，以君藥為主，兼顧臣、佐、使藥，本實驗采用HPLC 法同時測定君藥藿香主要成分廣藿香酮，臣藥厚樸主要成分和厚樸酚、厚樸酚，佐藥澤瀉主要成分24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B，茯苓主要成分去氫土莫酸、茯苓酸的含有量，為該制劑質量標準的提高完善提供理論依據和實驗基礎。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；XS-205DU 型電子天平（萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。 和厚樸酚（110730-201614， 含 有 量 99.3%）、 厚 樸 酚（110729-201714，含有量100.0%）、23-乙酰澤瀉醇B（111846-201705，含有量99.7%） 對照品購于中國食品藥品檢定研究院；廣藿香酮（23800-56-8，含有量98%）、茯苓酸對照品（29070-92-6，含有量98.0%） 對照品購于上海純優生物科技有限公司；24-乙酰澤瀉醇A（18674-16-3，含有量98.0%）、 去 氫 土 莫 酸 （6754-16-1， 含 有 量98.0%） 對照品購于南京森貝伽生物科技有限公司。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。藿砂顆粒（每 袋 裝10 g， 批 號20180919、 20180928、20181009） 購于福建中醫藥大學附屬人民醫院。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A） -0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0 ～13.0 min，52.0%A；13.0 ～18.0 min，52.0%→65.0%A；18.0 ～39.0 min， 65.0%→76.0%A； 39.0 ～47.0 min，76.0%→90.0%A； 47.0 ～55.0 min， 90.0%→52.0%A）；體積流量0.9 mL／min； 柱溫30 ℃；0～18.0 min 在310 nm 波長下檢測廣藿香酮［8-9］，18.0～30.0 min 在294 nm 波長下檢測和厚樸酚、厚樸酚［10-12］，30.0 ～55.0 min 在210 nm 波長下檢測24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B、去氫土莫酸、茯苓酸［10，13-14］；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取廣藿香酮、和厚樸酚、厚樸酚、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B、去氫土莫酸、茯苓酸對照品適量，甲醇分別制成0.292、 0.948、 1.210、 0.172、 0.574、 0.238、0.306 mg／mL，精密吸取適量，甲醇制成含廣藿香酮14.6 μg／mL、和厚樸酚47.4 μg／mL、厚樸酚60.5 μg／mL、24-乙酰澤瀉醇A8.6 μg／mL、23-乙酰澤瀉醇B 28.7 μg／mL、去氫土莫酸11.9 μg／mL、茯苓酸15.3 μg／mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取顆粒適量，研細，過80 目篩，精密稱取1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲 醇50 mL， 密 塞， 稱 定 質 量， 超 聲 提 取30 min，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照處方和生產工藝，分別制備缺廣藿香、厚樸、澤瀉、茯苓的陰性樣品，按“2.2.2” 項下方法制備，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統適用性試驗 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由圖可知，各成分均能達到有效分離，分離度均大于1.5；理論塔板數按各成分色譜峰計，均大于3 000；陰性樣品溶液相應位置無其他色譜峰，表明陰性無干擾。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關系考察 精密吸取“2.2.1” 項下對照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置于6 個20 mL 量瓶中，甲醇稀釋成25 倍梯度質量濃度，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗 精密吸取“2.2.1” 項下對照品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6次，測得廣藿香酮、和厚樸酚、厚樸酚、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B、去氫土莫酸、茯苓酸峰面積RSD 分別為1.03%、0.85%、0.68%、1.15%、0.94%、1.20%、1.02%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 取同一批顆粒 （批號20180919），按“2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得廣藿香酮、和厚樸酚、厚樸酚、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B、去氫土莫酸、茯苓酸含有 量 RSD 分 別 為 1.66%、 0.57%、 1.53%、0.88%、0.44%、1.91%、0.75%，表明該方法重復性良好。

2.3.5 穩定性試驗 取同一批供試品溶液（批號20180919），室溫下放置0、2、4、8、16、24 h 后在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得廣藿香酮、和厚樸酚、厚樸酚、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B、去氫土莫酸、茯苓酸峰面積RSD 分別為0.99%、 0.83%、 0.71%、 1.47%、 0.82%、1.18%、1.05%，表明溶液在24 h 穩定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取含有量已知的顆粒（批號20180919） 適量，研細，過80 目篩，精密稱取6 份，每份0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入對照品溶液（0.331 mg／mL 廣藿香酮1.0 mL、0.679 mg／mL 和厚樸酚2.0 mL、0.539 mg／mL 厚樸 酚3.0 mL、 0.194 mg／mL 24-乙 酰 澤 瀉 醇A 1.0 mL、0.681 mg／mL 23-乙酰澤瀉醇B 1.0 mL、0.253 mg／mL 去氫土莫酸1.0 mL、0.402 mg／mL茯苓酸1.0 mL），按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果， 廣藿香酮、 和厚樸酚、 厚樸酚、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B、去氫土莫酸、茯苓酸平均加樣回收率分別為97.61%、99.59%、100.03%、96.98%、98.57%、97.26%、98.29%，RSD 分 別 為 1.24%、 0.73%、 0.90%、 1.61%、1.36%、0.92%、1.03%。

2.4 樣品含有量測定 取3 批顆粒，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，平行3 份，在“2.1”項色譜條件下進樣測定， 計算含有量， 結果見表2。

表2 各成分含有量測定結果（mg／g，n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg／g，n＝3）

3 討論

本實驗比較了不同提取溶劑（50%甲醇、甲醇［10-11，14］、50%乙醇、 乙醇［8-9，12］）、 提取方法 （超聲［10-11，13-15］、 回 流［9］）、 提 取 時 間 （15、 30、45 min） 對藿砂顆粒中廣藿香酮、和厚樸酚、厚樸酚、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B、去氫土莫酸、茯苓酸7 種成分含有量的影響，最終確定供試品溶液制備方法為甲醇超聲提取30 min，此時各成分提取完全，同時干擾少，重復性良好。

4 結論

綜上所述，本實驗建立HPLC 法同時測定了藿砂顆粒中廣藿香酮、和厚樸酚、厚樸酚、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B、去氫土莫酸、茯苓酸的含有量，該方法操作簡便，靈敏度高，重復性好，可為該制劑質量標準的提高提供有力的數據支持。