柚皮素納米混懸劑的制備及其體內藥動學行為

裴巖巖， 閆春生， 牛美蘭， 郭志剛

（黃河科技學院，河南 鄭州450005）

柚皮素是一種二氫黃酮類化合物，廣泛存在于蕓香科植物中，具有抗病毒、抗氧化、抗炎、鎮咳、抗腫瘤、抗纖維化、預防動脈粥樣硬化等多種藥理活性［1-3］，顯示出巨大的潛在利用價值，但其溶解度不理想［4］，導致體內吸收較差，口服后藥效大打折扣［5］。

目前，納米制劑技術包括固體脂質納米粒［6］、脂質體［7］、 納米結構脂質載體［8］、自微乳等［9］，但都存在一定問題，如制備工藝復雜、載藥量較低等。納米混懸劑是指難溶性藥物通過濕磨、均質勻化等制劑技術制備而成的一種“純” 藥物膠態分散體系［10-13］，其制備工藝和處方簡單，載藥量大，適合工業化生產，有助于增加藥物溶解度、促進藥物吸收、提高生物利用度等，從而擴大臨床應用范圍。因此，本實驗制備柚皮素納米混懸劑，并考察其體內藥動學行為，為相關制劑研發提供參考。

1 材料

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（配置DAD 檢測器，美國Agilent 公司）； AR2140 型電子天平［梅特勒-托利多儀器 （上海） 有限公司］； DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州長城科工貿有限公司）；VORTEX-5 型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；ATS 型均質機（加拿大Seeker 公司）；RE5299 型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；MD200-2 型氮氣吹掃儀（杭州奧威儀器有限公司）；Master-sizer 型粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）。

柚皮素原料藥 （批號20170223， 含有量98.7%，西安瑞迪生物科技有限公司）；柚皮素對照品（批號Y-034-181217，成都瑞芬思生物科技有限公司）；卵磷脂（批號PC-98T，輔必成上海醫藥科技有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮K30 （PVP K30，批號25000240379，亞什蘭集團公司）；肝素鈉（批號20160511S，新泰市朝陽生化研究所）。

清潔級SD 大鼠，雌雄兼用，體質量（300±20） g， 河南省動物實驗中心， 動物許可證號SCXK（豫）2016-0001。

2 方法與結果

2.1 柚皮素含有量測定

2.1.1 色譜條件 Diamonsil BDS-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇-水（65 ∶35）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長287 nm；進樣量20 μL。

2.1.2 線性關系考察 精密稱取柚皮素對照品20.00 mg，加入50 mL 甲醇溶解，得400.0 μg／mL貯備液，甲醇稀釋成200.0、100.0、50.0、10.0、1.0 μg／mL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以峰面積（Y） 對溶液質量濃度（X） 進行回歸，得方程為Y ＝40.056 3X＋4.125 7（R2＝0.999 4），在1.0～200.0 μg／mL 范圍線性關系良好。

2.1.3 供試品溶液制備 精密量取納米混懸液0.5 mL，加入10 mL 甲醇超聲5 min，即得。

2.1.4 方法學考察 取供試品溶液，于0、4、8、12、24、48 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得柚皮素峰面積RSD 為0.64%，表明溶液在48 h內穩定性良好。取1.0、100.0、200.0 μg／mL 對照品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，連續6 d，測得日內精密度RSD 均小于0.52%，日間精密度RSD 均小于1.33%，表明該方法精密度良好。平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得柚皮素峰面積RSD 為1.39%，表明該方法重復性良好。空白納米混懸液分別配制成40、60、80 μg／mL，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得柚皮素平均加樣回收率為99.36%，RSD小于1.80%。取對照品溶液逐步稀釋，測得檢測限為0.5 ng／mL，定量限為1.2 ng／mL。

2.2 單因素試驗

2.2.1 表面活性劑種類 在制備溫度25 ℃、均質壓力60 MPa、均質次數10 次的條件下，考察PVP K30、卵磷脂、兩者混合物（1 ∶1） 對納米粒粒徑的影響。結果，平均粒徑分別為（281.42±5.93）、（224.79±6.07）、 （182.50±4.11） nm， 故選擇PVP K30-卵磷脂混合物（1 ∶1） 作為表面活性劑。

2.2.2 制備溫度 在表面活性劑PVP K30-卵磷脂（1 ∶1）、均質壓力60 MPa、均質次數10 次的條件下，考察制備溫度0、25、50 ℃對納米粒粒徑的影響，結果見圖1。由圖可知，在0 ℃時粒徑最小，故選擇其作為制備溫度。

圖1 制備溫度對粒徑的影響Fig.1 Effect of preparation temperature on particle size

2.2.3 均質壓力 在表面活性劑PVP K30-卵磷脂（1 ∶1）、制備溫度0 ℃、均質次數為10 次的條件下，考察均質壓力40、60、80、100 MPa 對納米粒粒徑的影響，結果見圖2。由圖可知，在均質壓力40 ～80 MPa 范圍內粒徑逐漸變小， 但增大至100 MPa時反而上升，故選擇80 MPa 作為均質壓力。

圖2 均質壓力對粒徑的影響Fig.2 Effect of homogenization pressure on particle size

2.2.4 均質次數 在表面活性劑PVP K30-卵磷脂（1 ∶1）、制備溫度0 ℃、均質壓力80 MPa 的條件下，考察均質次數6、8、10、12、15、20 次對納米粒粒徑的影響，結果見圖3。由圖可知，隨著均質次數增加粒徑逐漸減小，在12 次時最小，而15、20 次時略有變大趨勢，故選擇12 次作為均質次數。

圖3 均質次數對粒徑的影響Fig.3 Effect of homogenization frequency on particle size

2.3 納米混懸劑制備 根據“2.2” 項下結果，確定最優制備工藝為取50 mg 柚皮素溶于5 mL 無水乙醇中，作為溶液A；稱取泊洛沙姆、卵磷脂各0.1 g，加入50 mL 蒸餾水溶解，作為溶液B，在制備溫度0 ℃、轉速800 r／min 的條件下，將溶液A 緩慢滴加到溶液B 中，旋蒸約30 min 以除去乙醇，濃縮后體積約為40 mL，在80 MPa 均質壓力下均質12 次，即得。

2.4 粒徑、PDI、Zeta 電位測定 取納米混懸劑100 μL，3.5 mL 蒸餾水稀釋，測定粒徑、PDI、Zeta 電位，平行6 次，取平均值，測得三者分別為（161.67±4.23） nm、0.105±0.011、 （-30.47±1.15） mV。見圖4～5。

圖4 納米混懸劑粒徑分布Fig.4 Particle size distribution of nanosuspensions

圖5 納米混懸劑Zeta 電位Fig.5 Zeta potential of nanosuspensions

2.5 凍干粉制備 取納米混懸液若干份，每份4 mL，以5%甘露醇-乳糖（3 ∶2） 為凍干保護劑，按照表1 程序進行預凍、升華、解析，即得納米混懸液凍干粉。取0.2 g，0.5 mL 蒸餾水復溶，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項下方法進樣測定，測得含有量為2.22%，再按照納米混懸劑處方比例稱取柚皮素、輔料，加入蒸餾水、6%甘露醇-乳糖（3 ∶2），同法凍干，即得物理混合物凍干粉。

表1 凍干粉凍干程序Tab.1 Freeze-drying procedure for freeze-dried powder

2.6 體外釋藥行為 取納米混懸劑、物理混合物凍干粉各 0.2 g （以柚皮素計， 含有量為4.44 mg），裝入膠囊，按2015 年版《中國藥典》四部0931 項下二法進行考察，溫度（37±1）℃，轉速100 r／min，溶出介質100 mL 超聲水，于0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 min 各取樣3.0 mL，并補足至3.0 mL，溶液經0.22 μm 微孔濾膜過濾，HPLC 法測定柚皮素含有量，計算累積釋放度，繪制溶出曲線，見圖6。由圖可知，納米混懸劑凍干粉在40 min 時基本完全溶出，而物理混合物凍干粉在90 min 時僅為35.60%。

圖6 樣品體外釋放曲線Fig.6 In vitro release curves for samples

2.7 藥動學行為研究

2.7.1 灌胃液制備 取納米混懸劑、物理混合物凍干粉（以柚皮素計5 mg） 各228 mg，置于3 mL蒸餾水中，混勻，即得。

2.7.2 給藥方案及血漿采集 12 只大鼠隨機分為2 組，每組6 只，給藥劑量15 mg／kg，于0、5、10、15、30、45、60、90、180、240、360 min 眼眶采血各約0.3 mL， 置于肝素化離心管中，3 500 r／min離心5 min，分取上層血漿置于另一空白離心管中，-20 ℃冰箱中保存。

2.7.3 樣品處理［6］取血漿樣品100 μL，加入2%甲酸30 μL，渦旋3 min，繼續加入乙酸乙酯1.5 mL， 渦 旋8 min 提 取 后12 000 r／min 離 心15 min，上清液轉移至另一空白離心管中，45 ℃氮氣吹干，100 μL 甲醇復溶，置于進樣瓶內襯管中，在“2.1.1” 項條件下進樣20 μL 測定。

2.7.4 方法學考察 配制500、400、250、100、50、20 ng／mL 對照品溶液，各取300 μL，氮氣吹干后加入300 μL 空白血漿，振蕩混勻，即得對照品溶液，在“2.1.1” 項條件下進樣20 μL 測定，以峰面積（Y） 對溶液質量濃度（X） 進行線性回歸，得方程為Y＝0.112 7X＋9.687 2（R2＝0.998 6）。取20、250、500 ng／mL 對照品溶液，在“2.1.1”項條件下進樣測定6 次，測得柚皮素日內精密度RSD 均小于1.92%，表明該方法精密度良好。取處理后的血漿樣品溶液，48 h 內設置6 次進樣點，在“2.1.1” 項條件下進樣測定，測得柚皮素峰面積RSD 為1.88%，表明溶液在48 h 內穩定性良好。取500、250、50 ng／mL 血漿對照品溶液，在“2.1.1” 項條件下進樣測定， 測得回收率在91.38%～96.52%之間。

2.7.5 測定結果 繪制血藥濃度-時間曲線，通過3P97 程序統計矩模型計算主要藥動學參數，結果見圖7、表2。由此可知，納米混懸劑tmax較柚皮素顯著提前 （P ＜0.05），Cmax由 （203.81±30.41）ng／mL 提高至 （378.24±81.53） ng／mL， AUC0～t為后者的1.86 倍。

圖7 樣品血藥濃度-時間曲線Fig.7 Plasma concentration-time curves for samples

表2 樣品主要藥動學參數Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for samples

表2 樣品主要藥動學參數Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for samples

注：與柚皮素比較，*P＜0.05，**P＜0.01

參數 單位 柚皮素 納米混懸劑tCmmaxa x ng·m h L-1 20 13..98 61± ±03.0 3.74 1 37 18..02 84± ±08.1 1.9 53***AUC0～t ng·mL-1·h 706.57±81.54 1 318.19±143.79**AUC0～∞ ng·mL-1·h 719.34±84.17 1 406.44±150.91**

3 討論

在制備納米混懸劑過程中，有機溶劑與水互溶程度越高，攪拌條件下兩相混合時擴散越快，越有利于小粒徑納米粒快速形成，綜合考慮溶解度、毒性等因素，選擇無水乙醇作為制備溶劑。 據報道［14］，沉淀法制備納米粒是放熱過程，溫度較高時會增加納米粒子之間碰撞機會，容易出現晶體成長和納米粒聚集，故較低的制備溫度有助于獲得粒徑、PDI 均較小的納米混懸劑，本實驗選擇0 ℃（冰水混合物）。

另外，制備時需加入一定量表面活性劑，通過吸附于藥物粒子表面來提供電荷排斥作用或立體位阻作用，從而防止納米粒聚集，提高穩定性。前期預實驗對泊洛沙姆188、聚山梨酯80、聚乙烯醇等進行了篩選，發現所得納米粒粒徑均較大，其原因可能是這些表面活性劑不能吸附于納米粒表面，無法提供電荷排斥作用或立體位阻作用［15］。由于表面活性劑聯合應用可提高納米粒長期穩定性［16］，故實驗選擇PVP K30-卵磷脂（1 ∶1），此時所制備的納米粒粒徑較小。

體內藥動學研究結果顯示，柚皮素納米混懸劑相對生物利用度較原料藥提高了1.68 倍，其原因可能如下：納米粒口服后一部分可在伊派爾結（約占整個胃腸道黏膜的1／4） 中聚集，并通過淋巴結中的M 細胞最終進入血液循環［17-18］；增加了藥物與胃腸道的接觸面積，同時其黏附性使藥物在胃腸道停留時間延長，有助于充分吸收；納米混懸劑技術提高了柚皮素溶解度和溶出度，有助于溶解后的藥物順利吸收進入血液循環；處方中表面活性劑也具有促進藥物吸收的作用。據報道［19］，納米混懸劑生物利用度提高程度還受難溶性藥物基本性質（分子量大小、脂溶性、熔點、晶型、分子極性表面積等）、納米混懸劑本身理化性質（穩定性、溶解度、粒徑分布等）、機體生理特性等因素影響，故將不同難溶性藥物制成納米混懸劑后，其生物利用度提高程度存在較大差別，值得研究人員關注。