2 種斯皮諾素固體分散體的制備及其體內藥動學行為

張鐵山， 尚曙玉， 王聰穎， 張智強

（1.黃河科技學院，河南 鄭州450005；2.天津藥物研究院藥業有限責任公司，天津300301）

斯皮諾素是從鼠李科植物酸棗Ziziphus jujube Mill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 中分離得到的黃酮類化合物［1］，其性平，味甘、酸，歸肝、膽經，具有抗抑郁、抗心律失常、催眠、鎮靜、抗氧化等多種藥理活性［1-3］，但其水溶性很差［4］，從而限制了療效發揮及臨床應用。作為藥食同源兩用品［5］，開發出斯皮諾素高生物利用度制劑具有重要的現實意義，但目前國內外鮮見相關報道［6］。

固體分散體［7-9］由于制備工藝相對簡單，常作為改善中藥難溶性藥物的制劑技術之一，而近年來磷脂復合物固體分散體也逐漸受到國內外專家學者的關注［10-12］，它是在一定條件下將難溶性藥物與磷脂制成磷脂復合物后，進一步采用親水性高分子材料形成固體分散體。本實驗分別制備了斯皮諾素固體分散體、磷脂復合物固體分散體，并比較了兩者體內藥動學行為。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Bell-ennium 型加熱磁力攪拌器（上海書俊儀器有限公司）；FA1004 型電子分析天平（上海光學儀器廠）；XD-5000A 型真空旋轉蒸發儀（上海賢德實驗儀器有限公司）；XW-80A 型漩渦混合儀（上海醫科大學儀器廠）；TF-008-W 型氮氣吹掃儀（瑞誠科學儀器公司）；HTZ-92-01 型恒溫振蕩器（上海精怡科學儀器公司）；D8 型粉末衍射儀（德國布魯克公司）。

1.2 試藥 斯皮諾素對照品（批號T171220，瑞芬思生物科技有限公司）；斯皮諾素原料藥（批號160615001S，湖北巨勝科技有限公司， 含有量＞98%）；鹽酸普萘洛爾（批號100783-201401，中國食品藥品檢定研究院）；卵磷脂（批號PC-98T，輔必成上海醫藥科技有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮（PVK K30， 批 號 25000240379， 亞 什 蘭 集 團公司）。

1.3 動物 清潔級SD 大鼠，體質量200 ～240 g，購自河南省動物實驗中心，許可證號SCXK（豫）2016-0001，實驗前1 d 領取。

2 方法與結果

2.1 斯皮諾素含有量測定

2.1.1 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.15%磷酸（40 ∶60）；檢測波長336 nm；柱溫35 ℃；體積流量1.0 mL／min；進樣量20 μL。

2.1.2 方法學考察 精密稱取斯皮諾素對照品10.0 mg 至50 mL 量瓶中，乙腈超聲溶解，定容至刻度，混勻，取適量用流動相逐步稀釋，配制成50.0、 25.0、 5.0、 0.5、 0.05 μg／mL， 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，得方程為Y＝1.041 2X-1.208 3（r＝0.999 8），在0.05 ～50.0 μg／mL 范圍內呈良好的線性關系。取低 （0.05 μg／mL）、 中 （25.0 μg／mL）、 高（50.0 μg／mL） 質量濃度對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得峰面積RSD 均小于0.45%，表明儀器精密度良好；平均加樣回收率分別為99.01%、100.26%、100.09%，RSD 均小于1.66%；室溫下于5 d 內在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得峰面積RSD 為0.66%，表明溶液在5 d 內穩定性良好。

2.2 固體分散體制備及X 射線粉末衍射（XRPD）分析 采用溶劑揮發法制備固體分散體。取斯皮諾素0.2 g、PVP K30 1.2 g，加入100 mL 無水乙醇中，50 ℃下攪拌4 h，減壓旋蒸盡量除盡有機溶劑，即得，置于45 ℃真空干燥箱中24 h，敞口置于干燥器中。

XRPD 掃描分析條件為銅靶；管壓40 kV；掃描范圍3°～45°；掃描速度8°／min，結果見圖1。由圖可知，斯皮諾素以典型結晶狀態存在，而在固體分散體中轉變成無定型狀態；同比例物理混合物中原料藥的特征晶型峰仍可觀察到，表明其結晶狀態未得到改變。

圖1 固體分散體XRPD 圖Fig.1 XRPD pattern for solid dispersions

2.3 磷脂復合物固體分散體制備及XRPD 分析 取斯皮諾素0.2 g、卵磷脂0.25 g，置于50 mL 四氫呋喃中，45 ℃水浴攪拌4.0 h，真空旋蒸除去四氫呋喃，即得磷脂復合物。取0.2 g，按“2.2” 項下方法制備，即得。

對磷脂復合物及其固體分散體進行晶型分析，結果見圖2。由圖可知，斯皮諾素典型晶型峰在磷脂復合物中消失，呈無定型狀態；制成磷脂復合物固體分散體后，它同樣以無定型狀態存在，表明制備成功。

圖2 磷脂復合物固體分散體XRPD 圖Fig.2 XRPD pattern for phospholipid complex solid dispersions

2.4 表觀溶解度比較 取過量斯皮諾素、固體分散體、磷脂復合物、磷脂復合物固體分散體，加到10 mL 經超聲處理后的蒸餾水中，固定于25 ℃恒溫搖床上平衡2 d，15 000 r／min 下離心10 min，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，測定溶解度，結果見表1。由表可知，固體分散體、磷脂復合物、磷脂復合物固體分散體均可顯著提高斯皮諾素溶解度（P＜0.01）。

2.5 體外溶出度比較 取斯皮諾素、固體分散體、磷脂復合物、磷脂復合物固體分散體適量（以斯皮諾素計，含有量均為30 mg），2 mL 蒸餾水制成混懸液后置于活化處理的透析袋（7 000～14 000 Da）中，溫度37 ℃，轉速100 r／min，以900 mL 超聲處理后的蒸餾水為釋放介質，于180 min 內不同時間點取樣3 mL，補加釋放介質以保持總體積不變，0.45 μm 微孔濾膜過濾，HPLC 法測定斯皮諾素含有量，繪制溶出曲線，結果見圖3。由圖可知，固體分散體、磷脂復合物、磷脂復合物固體分散體可提高斯皮諾素體外溶出度，以固體分散體、磷脂復合物固體分散體更明顯。

表1 溶解度考察結果（，n＝3）Tab.1 Results of solubility investigation（，n＝3）

表1 溶解度考察結果（，n＝3）Tab.1 Results of solubility investigation（，n＝3）

注：與斯皮諾素比較，**P＜0.01

樣品 1表觀溶解度2／（μ g·mL-1）3平均值／（μg·mL-1）斯皮諾素 12.43 12.40 12.47 12.43±0.04固體分散體 139.70 139.92 139.86 139.82±0.11**磷脂復合物 26.53 26.39 26.44 26.45±0.07**磷脂復合物固體分散體 144.23 144.30 144.24 144.26±0.04**

圖3 樣品體外溶出曲線Fig.3 In vitro dissolution curves for samples

2.6 體內藥動學行為研究

2.6.1 灌胃液制備 取斯皮諾素及其固體分散體、磷脂復合物固體分散體適量，0.5%CMC-Na 溶液配制成10.0 mg／mL 混懸液 （以斯皮諾素計），即得。

2.6.2 分組、給藥及血樣采集［13］18 只大鼠隨機分為3 組，給藥前禁食不禁水12 h，按20 mg／kg劑量灌胃給予斯皮諾素、固體分散體、磷脂復合物固體分散體混懸液后，于0.5、1、3、5、7、9、10、12、14、16、24 h 眼眶取血各0.3 mL，同時補充適量生理鹽水，4 000 r／min 低溫離心2 min，血漿置于-20 ℃冰箱中保存。

2.6.3 內標、對照品溶液制備 精密稱取鹽酸普萘洛爾對照品10 mg 至10 mL 量瓶中，乙腈超聲溶解并定容至刻度，流動相稀釋至400.0 ng／mL，即得內標溶液。精密稱取斯皮諾素對照品10 mg 至50 mL 量瓶中，乙腈超聲溶解，室溫下放置0.5 h后定容至刻度，得200 μg／mL 貯備液，乙腈稀釋至800.0、400.0、200.0、100.0、50.0、10 ng／mL，即得對照品溶液。

2.6.4 樣品處理 吸取血漿100 μL、內標溶液（50.0 ng／mL）50 μL 至離心管中，加入1.5 mL 乙腈后渦旋6 min，分層后轉移上層有機相，調節氮氣吹速后緩慢吹去有機溶劑，100 μL 流動相復溶沉淀物，轉移至帶內襯管的進樣瓶中，待測。

2.6.5 線性關系考察 取“2.6.3” 項下不同質量濃度對照品溶液各500 μL，45 ℃氮氣緩慢吹干，加入 空 白 血 漿500 μL、 內 標 溶 液50 μL， 按“2.6.4” 項下方法處理，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖4。以對照品溶液質量濃度為橫坐標（X），斯皮諾素與鹽酸普萘洛爾峰面積之比為縱坐標 （Y） 進行回歸， 得方程為Y ＝0.003 2X-0.151 2 （R2＝0.990 9）， 在10 ～800.0 ng／mL范圍內線性關系良好。

圖4 斯皮諾素HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of spinosin

2.6.6 方法學考察 取10.0 ng／mL （低）、400.0 ng／mL（中）、800.0 ng／mL（高） 質量濃度血漿溶液， 日內精密度 （n ＝3） RSD 均小于10.66%， 日 間 精 密 度 RSD （n ＝3） 均 小 于10.26%，表明該方法精密度良好；血漿樣品于5 d內在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得斯皮諾素、內標峰面積比值無顯著差異（P＞0.05），表明樣品在5 d 內穩定性良好。100 μL 空白血漿配制成10.0、400.0、800.0 ng／mL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，將斯皮諾素、內標峰面積比值代入“2.6.5” 項下回歸方程，測得3 種質量濃度的方法回收率在86.96%～91.44%之間。

2.6.7 測定結果 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，通過3P97 程序統計矩模型計算主要藥動學參數，結果見表2，再繪制血藥濃度-時間曲線，結果見圖5。由此可知，固體分散體、磷脂復合物固體分散體主要藥動學參數較斯皮諾素均有顯著變化（P＜0.05，P＜0.01）；與前者比較，后者tmax顯著性延長（P＜0.01），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞顯著升高（P＜0.05），兩者相對生物利用度分別增加到219.61%、265.39%。

表2 樣品主要藥動學參數（，n＝6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for samples（，n＝6）

表2 樣品主要藥動學參數（，n＝6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for samples（，n＝6）

注：與斯皮諾素比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與固體分散體比較，*P＜0.05，**P＜0.01

參數 單位 斯皮諾素 固體分散體 磷脂復合物固體分散體tmax h 5.55±0.88 3.38±0.69△ 5.92±0.93**Cmax ng·mL-1 142.36±36.68 316.51±93.82△△ 406.11±108.02△△*AUC0～t ng·mL-1·h 1 033.75±182.34 2 270.28±426.19△△ 2 743.40±577.27△△*AUC0～∞ ng·mL-1·h 1 046.14±190.68 2 291.65±443.27△△ 2 861.93±597.89△△*

3 討論

口服制劑進入胃腸道后，需經溶解溶出才能被吸收進入血液循環，從而發揮其藥理作用，但難溶性藥物溶解度很差，導致其溶出受到極大限制，故提高其溶解度、溶出度成為提高口服吸收生物利用度的關鍵所在。本實驗顯示，將斯皮諾素制備成固體分散體后以無定型狀態存在，其溶解度、體外溶出度均明顯改善， 相對生物利用度增加到219.61%，有助于發揮其藥效；與原料藥相比，固體分散體tmax顯著提前（P＜0.05），可能與其促進藥物快速溶出有關［7］，但磷脂復合物固體分散體tmax與其相比又顯著延后（P＜0.01），可能是由于它可提高原料藥親脂性［4］，導致在胃腸道黏膜中發生了滯留［12-14］，同時其相對生物利用度增加到265.39%，Cmax、AUC0～t和AUC0～∞也顯著提高。

據報道［14-17］，磷脂復合物技術有助于改善藥物脂溶性，而將其制成固體分散體后對斯皮諾素水溶性的改善也會產生積極影響，并進一步增加原料藥體內吸收。另外，由于磷脂復合物本身黏性較強，故提高斯皮諾素累積溶出度的程度有限，這也印證了繼續將其制成固體分散體的必要性。

圖5 樣品血藥濃度-時間曲線Fig.5 Plasma concentration-time curves for samples

總之，將磷脂復合物、固體分散體技術聯用時，對提高水溶性、脂溶性均較差藥物的口服吸收生物利用度具有較好的借鑒意義，本實驗也為斯皮諾素今后相關研究奠定基礎［18-19］。