鯽魚惡臭假單胞菌的分離鑒定及藥敏分析

陳詩宇，王利

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）是一種革蘭氏陰性、需氧短桿菌，屬于假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、假單胞菌屬（Pseudomonas）[1]。惡臭假單胞菌是一種具有腐化作用的細(xì)菌，廣泛分布于土壤及自然水體中[7]。惡臭假單胞菌為淡水魚的一種致病菌，常從腐敗的魚中檢出[2]，嚴(yán)重影響了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[3]。惡臭假單胞菌可引起中華絨螯蟹爪無力[4]、雜交鲇皮膚褪色、潰爛[5]、大鯢死亡[6]、雜交鱘腸炎[7]及黑鯛腹水病[8]。惡臭假單胞菌也是一種人-禽-魚共患的病原菌[7]，能夠引起鴨[9]等禽類發(fā)病并且導(dǎo)致人食物中毒[10]。1998年，李慶山[10]等首次發(fā)現(xiàn)惡臭假單胞菌引起的食物中毒。鯽魚（Carassius auratus）為常見淡水魚，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展，鯽魚逐漸受到許多病原菌的感染，其中惡臭假單胞菌的感染日趨嚴(yán)重。該試驗從鯽魚中分離得到菌株SY4，并進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定、16SrDNA基因分析以及藥敏試驗等研究。這為進(jìn)一步研究惡臭假單胞菌特性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗魚樣品

鯽魚取自四川省成都市某養(yǎng)殖場，體長18 cm，體質(zhì)量164 g。

1.2 主要儀器及試劑

顯微鏡購買自LEICA BME公司，恒溫培養(yǎng)箱購買自上海齊欣科學(xué)儀器科技有限公司，PCR儀購買自Eppendorf Germany公司，生化鑒定藥品、抗菌藥物紙片均購買自杭州微生物試劑有限責(zé)任公司，電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)均購買自BioRAD公司，TaqMix、DL2000 DNA Marker均購買自北京天根生化科技有限公司。

1.3 細(xì)菌分離

取鯽魚腸道于MBS液體培養(yǎng)基（每1 000 mL MBS液體培養(yǎng)基由一水葡萄糖3.8 g、蛋白胨3.8 g、牛肉浸膏 3.8 g、淀粉 2.3 g、NaCl 3.3 g、KH2PO43.3g配成）中富集培養(yǎng)24 h，挑取培養(yǎng)的菌液，采用平板劃線法均勻的劃在MBS固體培養(yǎng)基（每1 000 mL MBS液體培養(yǎng)基添加20 g瓊脂）上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，純化傳代2～3次；挑取純化后的單菌落于MBS液體培養(yǎng)基中，置于37℃搖床中培養(yǎng)24 h，挑取菌液進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.4 生理生化鑒定

采用細(xì)菌微量生化鑒定管參照《伯杰士鑒定手冊》[11]測定分離菌株SY4的生理生化特性。

1.5 16SrDNA基因擴(kuò)增

用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）制備得模板DNA。應(yīng)用16SrDNA通用引物，正向引物 F:5'－AGAGTTTGATCCTGGCTTAG－3'，反向引物 R:5'－ ACGGCTACCTTGTTACGACTT－3'。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(50μL):2×Taq PCR mix 25 μL，引物各 1 μL，模板DNA 5μL，超純水 18μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性 5 min；94℃變性 30 s，54℃退火 30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，并將陽性樣品送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行16 SrDNA基因測序。

1.6 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將拼接序列提交至NCBI，同時利用Blast程序?qū)Ψ蛛x菌株SY4進(jìn)行16SrDNA序列相似性檢索，找出相似性最高的菌種及同屬菌株作為內(nèi)群，另選其他菌種作外群。運(yùn)用Clustalx 2.0軟件進(jìn)行多序列比對，再利用Mega 5.0軟件，運(yùn)用Neighbour-Joining方法，自舉1 000次構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.7 藥敏試驗

采用標(biāo)準(zhǔn)Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散的方法，對分離菌株SY4進(jìn)行諾氟沙星、慶大霉素等11種常用抗生素的敏感性檢測，并根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會（CLSI/NCCLS）執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離

分離菌在MBS固體培養(yǎng)基上長出大小均一的菌落。可觀察到黃色、光滑、不透明的菌落。革蘭氏染色觀察為革蘭氏陰性菌，呈短棒狀，如圖1。

2.2 生理生化鑒定

圖1 革蘭氏染色形態(tài)圖（400×）

經(jīng)鑒定管反應(yīng)測定了SY4菌株的理化特性，結(jié)果見表1，理化指標(biāo)初步確定SY4菌株為惡臭假單胞菌。

表1 SY4的生理生化特征

2.3 16SrDNA基因擴(kuò)增及分析

以菌株SY4 DNA為模板，采用16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到產(chǎn)物的長度約為1 500 bp（圖2），實際測序結(jié)果為1 424 bp。將此序列提交至NCBI（登陸號：MH142393），用 Blast程序進(jìn)行比對分析，得出SY4菌株與NCBI中的惡臭假單胞菌屬的相似性最高。

圖2 16SrDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 16SrDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

將菌株的16 SrDNA基因序列與NCBI中已有序列進(jìn)行Blast比對，結(jié)果顯示SY4菌株與假單胞菌屬種類同源性高（99%）。選取同源性高的假單胞菌屬的16 SrDNA基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），結(jié)果顯示SY4菌株與惡臭假單胞桿菌（P.putida）顯著聚為一支。

圖3 SY4菌株16SrDNA基因序列與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果（表 2）顯示：SY4菌株對米諾環(huán)素、慶大霉素、卡那霉素、諾氟沙星等4種抗生素高度敏感；對多粘霉素B、頭孢曲松等2種抗生素中度敏感；對磺胺甲基異惡唑、氨芐西林、甲氧芐定、復(fù)方新諾明、舒巴坦等5種抗生素耐藥。

3 討論

該研究從鯽魚中分離得到菌株SY4，通過對該菌的培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、生理生化分離鑒定初步判定該菌為惡臭假單胞菌。在生理生化鑒定階段，楊圓圓等[7]對雜交鱘源惡臭假單胞菌的研究中，果糖顯示為陽性，而SY4菌株的研究中，果糖顯示為陰性；楊潤德[12]等對丹頂鶴惡臭假單胞菌的研究中，枸櫞酸鹽顯示為陽性，而SY4菌株的研究中，枸櫞酸鹽顯示為陰性；在《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》[11]中的模式菌株惡臭假單胞菌對枸櫞酸鹽、葡萄糖顯示為陽性，吲哚反應(yīng)顯示為陰性，而SY4菌株對枸櫞酸鹽、葡萄糖顯示為陰性，吲哚反應(yīng)顯示為陽性。造成這種差異的原因可能是菌株的來源以及試驗的環(huán)境不同。因此，采用傳統(tǒng)的生理生化鑒定方法進(jìn)行菌的準(zhǔn)確判定結(jié)果可能存在一定誤差。該方法受菌株的來源、試驗環(huán)境以及試驗操作的影響，尤其對一些不常見菌、疑難菌的鑒定也可能比較薄弱[13]。鑒于此原因，該研究還采用了以16SrDNA為基礎(chǔ)的細(xì)菌分離鑒定方法對SY4菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行測序，經(jīng)在NCBI中比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，分離菌株SY4與惡臭假單胞菌聚在一起。因此，結(jié)合傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法和16SrDNA測序法綜合判定SY4菌株是惡臭假單胞菌，從而提高了細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確性。

表2 SY4菌株藥敏試驗結(jié)果

關(guān)于惡臭假單胞菌的耐藥性目前僅有少量報道。毛之娟等[14]和段亞佼等[5]報道了惡臭假單胞菌對卡那霉素和諾氟沙星高度敏感。該試驗中分離菌株SY4對這兩種抗生素的敏感性與之相同。但是楊圓圓等[7]研究的結(jié)果顯示：惡臭假單胞菌對卡那霉素和諾氟沙星中度敏感，該研究結(jié)果與之不同，原因可能是菌株來源，地理環(huán)境及用藥情況等不同。根據(jù)分離菌株SY4對抗生素敏感性的研究結(jié)果，高度敏感抗生素中的故米諾環(huán)素、慶大霉素等都可作為預(yù)防和治療惡臭假單胞菌的推薦用藥。但相關(guān)研究表明,隨著廣譜抗生素的廣泛使用，惡臭假單胞菌的耐藥性越來越強(qiáng)，使得對惡臭假單胞菌的治療更加困難[15]。因此，通過益生菌調(diào)節(jié)魚類腸道微生物的種群數(shù)量可能是預(yù)防和治療該病的策略之一。