降解滁菊莖稈產纖維素酶的紅綬曲霉MFCJ鑒定

錢明敏 章 鵬 許婷婷 許慧敏 孫 寒 羅 俠 孫 星

（滁州學院生物與食品工程學院，安徽滁州 239000）

纖維素作為地球上分布最廣、含量最豐富的碳水化合物，經纖維素酶降解之后可轉化為食物、燃料和化學制品，應用十分廣泛，涉及到人類的衣、食、住、行等方方面面，是人類擁有的最具前景的資源之一［1］。纖維素酶是一類能夠水解纖維素的β-D-糖苷鍵生成葡萄糖的多組分酶的總稱。從類別上看，它屬于核苷水解酶類，廣泛存在于微生物和一些植物體中。而由于在纖維素酶生產過程中，存在纖維底物需求高度復雜、生產成本較高、纖維素酶活力較低、生產周期長等問題，導致當前纖維素酶制造產業在我國依然處于研究開發的階段。因此，尋找、開發活力高、針對性強的產纖維素酶菌株是高效利用纖維素資源的關鍵［2-3］。

滁菊作為全國4大白菊之首，素有“金心玉瓣，翠蒂天香”之美譽。在滁州，每年滁菊收獲后都會殘留大量的莖稈，莖稈直接還田后由于其高纖維素含量，造成土壤碳氮比失調、土壤板結等一系列問題。本研究通過對滁菊種植地地上中產纖維素酶分解菌進行分離與篩選鑒定，旨在篩選出能最大程度地降解滁菊莖稈的高產纖維素酶菌株。

1 材料與方法

1.1 采集樣品在滁菊種植田中間部位對樣本土壤進行“S”型采樣，為了避免實驗的偶然性，共采取5處的土壤樣品。

1.2 制備培養基以纖維素為唯一碳源的固體培養基：在500mL赫奇遜（hutchison）營養液中加入濾紙漿5mL，瓊脂粉10.00g。赫奇遜營養液：磷酸二氫鉀1.00g，氯化鈉0.10g，硝酸鈉2.50g，硫酸鎂0.30g，三氯化鐵0.01g，氯化鈣0.10g，蒸餾水1000mL，pH7.2左右。濾紙漿：定量撕碎的濾紙和適量水于燒杯中煮沸1h，并用玻璃棒不斷攪拌，制成懸浮物備用。纖維素-剛果紅培養基：百思生物公司購買。產酶培養基：滁菊莖稈粉末26.00g，硫酸銨1.89g，硫酸二氫鉀5.31g，硫酸鎂0.30g，氯化鈣0.30g，吐溫1.50mL，硫酸亞鐵0.005g，硫酸鋅0.0014g，硫酸錳0.0016g，氯化鈷0.002g，蒸餾水1000mL。

1.3 初篩產纖維素酶菌種稱取土壤樣品1g，放入含99mL無菌水的錐形瓶中，振蕩搖勻。然后按10倍濃度梯度分別稀釋成10-3，10-4稀釋液。將已滅菌的以纖維素為唯一碳源的培養基倒入培養皿中，待其冷卻凝固后，用無菌移液管吸取0.2mL稀釋液倒入平板上，再用玻璃涂布棒在平板表面輕輕涂抹以至均勻，最后將平板放置于30℃左右的恒溫培養箱中倒置培養48h。

1.4 復篩產纖維素酶菌種將初篩分離得到的菌種用接種環劃線到纖維素-剛果紅培養基上，再將上述平板置于恒溫培養箱中培養2～3d后，觀察是否有透明圈生成。

1.5 分離純化目的菌株將上述4種產生透明圈的菌落用接種環分離純化，接種劃線至以纖維素為唯一碳源的固體培養基上，再將這些平板置于恒溫培養箱中培養48h。

1.6 制備斜面固體培養基在100mL的赫奇遜（hutchison）中加入濾紙漿1mL，瓊脂粉2.00g，制成培養基，在4個試管中分別倒入15mL已配好的培養基，傾斜15°待其冷卻凝固后接種上述已純化菌落，放入冰箱中冷藏保存，以便備用。

1.7 制備粗酶液將上述已分離純化的菌株接種到產酶培養基中，于28℃下在振蕩水浴鍋中恒溫培養5d，轉速為160r/min。然后，將發酵液經5000r/min的轉速離心10min，除去菌體后保留上層清液，即為所得粗酶液。

1.8 測定酶活力采用分光光度法測定酶液吸光值。以3，5-二硝基水楊酸（DNS）為顯色劑在550nm處測得不同濃度葡萄糖的吸光值。以葡萄糖濃度為橫坐標，以分光光度計測得的吸光值為縱坐標，繪制葡萄糖的標準曲線。0.5mL各酶液分別加入0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液于50℃水浴鍋中水浴糖化30min，取出后，沸水浴得糖化液，冷卻，再分別加入2mLDNS顯色劑，沸水浴中煮沸10min，待其冷卻，加水定容稀釋5倍，振蕩混勻后，在550nm處測得各酶液的吸光值。纖維素酶活力單位=（N×OD550值對應的葡萄糖量）/（30×1）。通過標準曲線求得各菌種在550nm處OD值所對應的葡萄糖量，代入公式即得每克各菌種中纖維素酶活力單位。

1.9 鑒定目的菌株將2號菌株接種至稍厚的平板中，實用載玻片進行插片培養數日后，拿去做鏡檢觀察，并將接種有2號菌株的斜面固體培養基寄往通用生物公司測定其DNA序列。根據所得到測序目的序列到NCBI進行Blast比對，并構建發育樹。

2 結果與分析

2.1 產纖維素酶菌種的初篩從滁菊產地的土壤樣品中，以纖維素為唯一碳源的培養基篩選微生物。篩選到5種可以在以纖維素為唯一碳源的培養基上生長。

2.2 產纖維素酶菌種的復篩和分離純化將初篩分離得到的菌種用接種環劃線到纖維素-剛果紅培養基上，再將上述平板置于恒溫培養箱中培養2～3d后，觀察有透明圈生成。結果發現有4種菌落周圍生成了清晰可見的透明圈，給其編號為1，2.3，4。

2.3 產纖維素酶菌種的酶活力不同濃度的葡萄糖標準液在550nm處的吸光值并得到葡萄糖標準曲線（圖1）。

圖1 不同濃度的葡萄糖標準液在OD550處的吸光值

利用分光光度計測出樣品在550nm處的吸光值，求得每克各菌種中纖維素酶活力單位（表1）。比較表1中纖維素酶活力大小，得出2號為篩選的目的菌株。

表1 各菌種的酶液在550nm處的吸光值

2.4 產纖維素酶菌株鏡檢鑒定對2號菌株進行顯微鏡觀察：目的菌株菌落黃綠色，外觀干燥不透明，質地疏松，呈絲絨狀，在顯微鏡下觀察清晰可見頂囊球形或燒瓶形，分生孢子呈近球形或橢圓形（圖2），初步鑒定為霉菌［11］。

圖2 目的菌株在高倍顯微鏡下的鏡檢結果（放大倍數：上：10×10；下：10×40）

2.5 產纖維素酶菌株分子鑒定1%的瓊脂糖鑒定（如圖3～4）并使用Axygen凝膠回收試劑盒回收所需PCR產物片段。PCR產物進行測序，跑3730XL測序儀，根據所得到測序目的序列到NCBI進行Blast比對（圖5），并構建發育樹（圖6）。經對比后發現目的菌株與紅綬曲霉親緣關系最為接近，故將其命名為Aspergillus nomius.MFCJ。

菌株MFCJ的序列如下：

TTCCTCCGCCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGG GTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGAAAGAATG GTTGTTTTGCGTTCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTA CAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGAT CGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTAGGGCCCGTCCCC CCCCGGAGAGGGGGACGACGACCCAACACACAAG CCGTGCTTGATGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGG CATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCG TTCAAAGACTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCAC ACTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATG CCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACT GATTGCGATACAATCAACTCAGACTTCACTAGATCGTT CAGAGTTCGTGGTGTCTCCGGCGGGCGCGGGCCCG GGGGCGGATGCCCCCCGGCGGCCTTGCGGCGGGCC CGCCGAAGCAACTAAGGTACAGTAAACACGGGTGGGA GGTTGGGCTCGCTAGGAACCCTACACTCGGTAATG ATCCTTCCGCAGGTTCACCCTACGGAAGG

圖3 瓊脂糖鑒定結果

圖4 樣品膠

Blast比對結果：

圖5 Blast比對結果

構建發育樹如下：

圖6 目的菌株發育樹

3 結論

通過對滁菊種植基地土壤中產纖維素酶分解菌進行分離篩選與鑒定，并對分離出的菌株所產纖維素酶進行活力檢測，結果表明，所得的Aspergillus nomius.MFCJ菌株能很好地降解滁菊莖稈，使滁菊莖稈得到充分有效的利用。