鼎湖山國家自然保護區林下土壤微生物新結構生物活性代謝產物的研究進展

李翰祥, 魏孝義

鼎湖山國家自然保護區林下土壤微生物新結構生物活性代謝產物的研究進展

李翰祥, 魏孝義*

(中國科學院華南植物園, 廣州 510650)

鼎湖山國家自然保護區特殊的地理位置和氣候條件造就了獨特的生態環境，孕育了豐富的植物和微生物資源。為了挖掘其中的微生物資源，對近年來鼎湖山林下土壤來源的真菌和放線菌次生代謝物研究進行了綜述。

鼎湖山；微生物；真菌；放線菌；次生代謝產物；活性物質

微生物作為自然界中多樣性最高的生命形式,能夠合成數量巨大、結構復雜的次生代謝物。就藥物發現途徑而言，從微生物代謝產生的新結構物質中尋找新藥先導化合物已經成為世界藥學界公認的有效方法[1–2]。當前的微生物源藥物創制中，特殊生境來源的微生物是研究的熱點和重點，這些特殊生境包括海洋、極地、高山、熱帶雨林、荒漠等。細菌和真菌在與特殊的生態環境相互作用中，形成了獨特的適應能力和代謝防御機制。但是受到樣品采集等技術的限制，長期以來缺乏對特殊生境中的微生物資源的認識和研究。收集和發掘這些新的菌種資源，保護和研究特境微生物新的基因資源，將是天然藥物創制的重要途徑。

鼎湖山國家級自然保護區(以下簡稱鼎湖山)位于廣東中西部，是我國第一個國家自然保護區，也是我國第一批加入聯合國科教文組織“人與生物圈”計劃的世界生物圈保護區。鼎湖山地處北回歸線上，屬于南亞熱帶季風濕潤型氣候，冬夏氣候交替明顯，分布著南亞熱帶森林生態系統，是我國生物多樣性最豐富的地區之一。最為典型的是其中包括有400年保護歷史的南亞熱帶季風常綠闊葉林，其林下土壤腐殖質中有機碳、氮，以及微量元素含量豐富，為微生物的生長提供了優良的生境和條件,林下土壤微生物資源具有豐富的生物多樣性。

近年來本研究組針對鼎湖山林下土壤豐富的微生物資源，對其進行了系統的分離、純化工作，重點對收集得到的菌株的次生代謝物進行研究，旨在從中發現新結構活性物質，為藥物先導化合物的發現提供物質基礎。目前從林下土壤中分離、收集了近1 200株菌株，通過活性篩選從中發現了一些對真菌和細菌有顯著活性的菌株，對其中活性菌株的代謝產物進行了研究，共分離、鑒定了309個化合物，其中135個為新化合物，包括31個新骨架結構化合物。現將近年取得的研究進展綜述如下。

1 產紫青霉中新碳架甾醇及其抗炎、細胞毒活性

甾醇作為生物學中重要的小分子，是真核生物細胞膜的組成成分，具有多種與細胞膜結構和信號功能相關的細胞功能。甾醇類藥物在醫藥市場占據重要領域，對提高生活質量、預防和治療疾病具有重要意義。因此，甾醇及其衍生物不斷引起化學家和生物學家的關注。對鼎湖山林下土壤真菌產紫青霉() SC0070的固體發酵產物進行研究，分離得到1個具有稀有四環碳架重排的甾醇penicillitone (1)和1個新的類似物penici- llisterol (2) (圖1)[3]。對1可能的生源途徑分析表明，該化合物可能以麥角甾醇為前體，通過脫氫氧化形成四烯酮1b，并進一步氧化裂解C-14和C-15間的雙鍵得到中間體1c，在此基礎上通過-烯醇化以及分子內的烯醇羥醛縮合得到化合物1。上述途徑的關鍵步驟在于C-14和C-15位間的氧化裂解，該步反應不僅產生了親電基團C-15位的醛基，同時還在C-8的位(C-14)形成了,-不飽和酮羰基。后者的形成增強了-氫(H2-11)的酸性，進而促進了-烯醇化和提高了羥醛縮合的反應活性。這類生源合成機制在目前甾醇生物合成或化學轉化中尚未見報道，其中的可能中間體1c，結構中含鄰位具有酮基的,-不飽和酮羰基片段，將為設計構建新的烯醇羥醛縮合反應基元提供啟示。

圖1 化合物1和2的結構及1可能的生源途徑

活性測試表明，化合物1對腫瘤細胞株A549、HepG2和MCF-7具有強的生長抑制活性，IC50分別為(5.57±0.19)、(4.44±0.24)和(5.98±0.22)mol L–1，但是類似物2對上述細胞株不顯示活性。同時，化合物1能夠劑量依賴性地降低脂多糖誘導RAW264.7巨噬細胞的炎癥反應，抑制腫瘤壞死因子-(TNF-)和白介素-1(IL-6)的生成。這表明化合物1作為新的分子骨架，在抗炎和抗腫瘤先導物的設計合成中具有研究前景。

2 枝頂孢霉來源的新結構枝頂孢素及抗菌肽

枝頂孢屬真菌(sp.)屬于子囊菌亞門,世界上約有130種，分布廣泛，形態學特征是分生孢子的孢子鏈或頂端有單細胞(極少數為雙細胞)的瓶梗孢子。鼎湖山林下土壤分離的真菌菌株SC0105，經形態學和分子生物學鑒定為。該菌株的發酵產物粗提物對金黃色葡萄球菌顯示抑菌活性。對發酵產物的化學成分研究表明，SC0105代謝合成了一系列骨架新穎的混源萜類枝頂孢素(acremins)二聚體bisacremines A~G (3~9)及單體衍生物(10) (圖2)[4–5]。化合物7~9中含有的多環碳架結構生源上可能基于[4+2]環加成反應。化合物bisacremine E能夠抑制脂多糖誘導RAW264.7巨噬細胞中腫瘤壞死因子-(TNF-)和白介素-1(IL-6)的生成。非對映異構體3~6在對腫瘤細胞株HeLa細胞毒活性測試顯示，含有THF環的bisacremine A和B (3和4)活性強于含有THF環的bisacre- mine C和D (5和6)，構效關系顯示構型依賴性。

圖2 化合物bisacremines A~G (3~10)的結構及7~9可能的生源途徑

該菌株的另外一組特征性次生代謝物是抗菌肽(peptaibiotics)。抗菌肽是一類能夠通過細胞膜脂質雙分子層，建立電壓依賴性離子通道的小分子多肽，具有抗菌、抗病毒、抗真菌和細胞毒性等多種生物學特性。該類化合物以其獨特的結構、優越的生物活性和特異的作用方式，引起了科學界和制藥業的廣泛關注。從該株菌的固體發酵物中分離獲得了一組新的抗菌肽acremotinsA~D (11~14) (圖3)[6], 其結構中含有特征性的3個,-二烷基氨基酸-亞氨酸結構基元和一個未被還原的C-末端殘基。通過改良的Marfey法確定了acremotins A~D (11~14)中氨基酸殘基的絕對構型。此外，采用密度泛函理論(DFT)和從頭算方法(initio)對acremotin D (14)進行了理論構象分析，并確定了該化合物的三維空間結構(圖4)。Acremotin D (14)顯著抑制金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant, MRSA)，MIC分別為12.5和6.25g mL–1。細胞毒活性測試還表明，acremotin D (14)具有強的細胞毒活性，對HepG2細胞株的IC50值為1.2mol L–1。

3 擬青霉屬真菌來源的β-雷瑣酸大環內酯及其生物活性

-雷瑣酸大環內酯(-resorcylic acid lactones, RALs)是一類結構獨特的真菌聚酮類代謝產物，結構母核中含有-雷瑣酸(2,4-二羥基-苯甲酸)并合的14元內酯環。生源上，-雷瑣酸大環內酯結構母核的形成基于芳香環C-6上的烷基側鏈中的C-10?與C-1位的羧基酯化反應，同時，烷基鏈上的不同修飾取代賦予了該類化合物的結構多樣性。對鼎湖山林下土壤真菌代謝產物進行活性篩選表明，擬青霉屬真菌(sp.) SC0924對荔枝霜疫霉()顯示抗真菌活性。對該菌株次生代謝物進行研究，從中獲得了一系列新結構-雷瑣酸大環內酯[7–11]：paecilomycins A~P (15~30)、dechlo- ropochonin I (31)、monocillin VI (32)、monocillin VII (33)、4′-hydroxymonocillin IV (34)和4′-methoxy- monocillin IV (35)。上述結構基于C-10′的絕對構型，可分為hypothemycin型(10′)和radicicol型(10′)兩類。就化學結構而言，化合物28和29含有新穎的6/11/5環系結構。化合物19對瘧原蟲() 3D7具有顯著抑制活性(IC50=20.0 nm),化合物32和34能夠抑制荔枝霜疫霉，化合物28、32和33對腫瘤細胞株MCF-7、A549和HeLa具有顯著細胞毒活性。

圖3 抗菌肽acremotins A~D (11~14)的結構

圖4 抗菌肽acremotin D (14)立體結構圖。A: 理論計算3D結構圖和靜電勢表面圖; B: 理論計算3D肽鏈骨架(藍色)與類似物[Leu1]zervamicin單晶(黃色)疊合圖。

4 漆斑屬真菌來源的醌基倍半萜及其細胞毒、抗菌活性

醌基倍半萜(quinone sesquiterpenes)作為重要的混源雜萜，結構中含有醌基取代的drimane倍半萜基團。醌基倍半萜結構多樣并具有突出的生物活性，如抗艾滋病毒、抗結核、蛋白激酶抑制和免疫抑制活性。從鼎湖山林下土壤來源的漆斑屬真菌(sp.) SC0265的小麥固體發酵產物中, 分離得到一組新的醌基倍半萜myrothecols A~F (36~41)和已知類似物hymenopsin B (42) (圖6), 通過構象分析和ECD量子化學計算確定了該組化合物的絕對構型[12]。化合物36對金黃色葡萄球菌(MIC=12.5g mL–1)和蠟狀芽孢桿菌() (MIC=25.0g mL–1)具有抗菌活性。細胞毒活性實驗中，化合物42的細胞毒活性最強，對3株腫瘤細胞MCF-7、A549和HeLa的IC50值為1.3~ 4.5mol L–1。

5 白粉寄生菌來源的新型碳環糖

碳環糖(carbasugar)是一類呋喃或吡喃糖環中的氧原子被亞甲基取代后形成的糖類似物。作為糖類化合物的類似物，碳環糖卻有著不同的活性和穩定性，引起了有機合成化學和藥理學研究領域的廣泛關注。白粉寄生菌(sp.) SC0307于2002年分離自鼎湖山林下土壤，從其固體發酵提取物中，分離得到一組多羥基取代的甲基環己醇ampelomins A~G (43~49，圖7)[10]。其中化合物43、45、47和49對-葡萄糖苷酶具有弱的抑制活性,化合物43對菌株金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、變形桿菌和銅綠假單胞菌顯示中等抑菌作用。

6 高等真菌代謝產生的萜類物質及其生物活性

高等真菌，也稱大型真菌，通常指能產生子實體的一類真菌，包括擔子綱真菌和部分子囊綱真菌，因其代謝產物的結構新穎性和藥理活性的顯著性, 在真菌活性物質研究中占據重要地位。從鼎湖山采集的擔子菌殺線蟲活性篩選中發現，污叉絲孔菌() SC0197具有殺線蟲活性，從該菌株固體發酵物中鑒定了一組新型倍半萜類化合物(圖8)[13–14]。化合物56對松材線蟲()的LC50為35.6g mL–1。其中化合物52具有1,10-裂-2,3-裂-香橙烷結構，該類骨架為首次報道。研究另一株有毒擔子菌——鬼傘目(Coprinaceae)花褶傘屬真菌() SC0641的活性成分[15]，從中得到了2個新的伊魯烷(illudane)倍半萜paneolic acid (57)和paneolilludinic acid (58) (圖8), 這兩個倍半萜對金黃色葡萄球菌有抑制活性。

圖5 β-雷瑣酸大環內酯15~35的結構

圖6 醌基倍半萜myrothecols A~F (36~41)和hymenopsin B(42)的結構

圖7 碳環糖ampelomins A~G (43~49)的結構

圖8 高等真菌來源的倍半萜50~58的結構

7 放線菌來源的環酯肽素dinghupeptins A~D及抗菌成分

在對鼎湖山林下土壤微生物次生代謝物研究中，除了對真菌的新結構活性物質進行研究外, 還關注了放線菌代謝產生的活性物質。從其中1株鏈霉菌(sp.) SC0581的代謝產物中,獲得了4個具有顯著糜蛋白酶選擇性抑制活性的環酯肽類化合物——鼎湖山肽素A~D (dinghupeptins A~D, 59~62) (圖9)，首次運用量子化學計算從頭算方法確定了該類化合物的絕對構型，并通過酶動力學試驗和分子對接探討了這些活性分子的作用機制和結合位點(圖10, 11)[16]。化合物59~62分子中具有特征性的Ahp環結構，該類環酯肽家族龐大，大部分存在于藍藻中，并多具有絲氨酸蛋白酶抑制等活性，是絲氨酸蛋白酶生物功能研究的潛力天然分子探針，受到藥物化學、天然產物化學和有機合成化學等研究領域的廣泛關注。本研究從放線菌中發現的該系列新結構成分，以及該組化合物絕對構型的確定和酶抑制機理的探討，對環酯肽化學生物學功能及其相關研究具有重要意義。

圖9 鼎湖山肽素A~D(59~62)及化合物63和64的結構

圖10 鼎湖山肽素A (59)理論計算最低能量構象及ROESY相關圖

圖11 鼎湖山肽素與α-糜蛋白酶分子對接圖

另一株放線菌師崗鏈輪絲菌() SC1169發酵提取物對熱帶水果重要病原菌荔枝霜疫霉具有抑制活性，從中分離鑒定了2個新的生物堿(圖9)[17]，包括咔唑類生物堿鏈輪絲菌素(streptoverticilin，63)和結構中含有2-氮雜環丁酮(2-azetidinone)的鏈輪絲菌酮(streptoverticilinone, 64)。其中63對荔枝霜疫霉的抑菌作用與農業用殺菌劑多菌靈(carbendazim)的活性相當。

8 結語

綜上所述，鼎湖山特殊的地理位置和獨特的水熱條件孕育了珍稀的生物資源，其林下土壤微生物具有豐富的生物多樣性，對這些真菌和放線菌次生代謝物進行研究，從中獲得了一系列結構新穎、活性顯著的化合物，為新型藥物先導化合物的發現提供了物質基礎。同時，鼎湖山林下微生物在遺傳背景和次生代謝機制上具有獨特性，是發現新結構活性物質的寶貴資源，這也為鼎湖山生物資源的系統研究和可持續利用提供了借鑒和啟示。

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New Bioactive Metabolites of Microorganisms Derived from Forest Soil in Dinghu Mountain National Nature Reserve

LI Han-xiang, WEI Xiao-yi*

(South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510650, China)

The particular geographical location and climate conditions of Dinghu Mountain National Nature Reserve create a unique ecological system and breed diverse plants and microbials. In order to exploit microbial resources for discovery of bioactive substances, the bioactive secondary metabolites of the fungi and actinomycetes derived from forest soil in Dinghu Mountain National Nature Reserve has been focused. Some recent progresses of this work are summarized.

Dinghu Mountain; Microorganism; Fungus; Actinomycete; Secondary metabolite; Bioactive natural product

10.11926/jtsb.4103

2019–06–06

2019–07–17

國家自然科學基金項目(20672114, 81172942, 30901856, 21502197, 81872773)資助

This work was supported by the National Natural Foundation of China (Grant No. 20672114, 81172942, 30901856, 21502197, 81872773).

李翰祥(1981~ )，男，博士，助理研究員，研究方向為天然產物化學。E-mail: lihanxiang@scbg.ac.cn

E-mail: wxy@scbg.ac.cn