兒童初診原發免疫性血小板減少癥患者細胞及體液免疫功能分析

倪蔚文，儲金華，楊林海，劉亢亢，王寧玲

原發免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia, ITP)是一種兒童常見的獲得性自身免疫性出血性疾病，年發病率約為(1～6.4)/100 000，發病高峰年齡為2～5歲[1]。該病存在重要臟器或顱內出血引起死亡的風險，據報道，重癥ITP患者的死亡率每年約為1%～3%[2-3]。初診ITP患兒的預后一般較好，其對糖皮質激素、靜脈丙種球蛋白(intravenous immune globulin, IVIG)一般都有較好的治療反應。然而，仍有約20.0%的患兒治療效果不佳，病程遷延、進展為慢性ITP[4]。

免疫紊亂在ITP的發病機制中具有重要作用，但其發病機制目前尚不明確，目前的研究認為體液免疫和細胞免疫異常都可能參與了ITP的發病。然而，由于ITP好發于年輕女性及年齡大于60歲的老年人，目前的許多研究都是針對成人患者，針對兒童患者的研究則較少。該研究旨在對收治的51例初診ITP患兒的臨床資料及相關免疫指標進行分析，提高臨床上對兒童ITP發病機制的認識，從而為臨床上合理選擇藥物提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集安徽醫科大學第二附屬醫院2013年1月～2018年6月確診的51例初診ITP患兒的臨床資料。診斷標準依靠2013年版《兒童原發性免疫性血小板減少癥診療建議》[5]。在收集這些患兒臨床資料的同時，進一步分析了與患兒細胞免疫及體液免疫相關的實驗室指標，包括球蛋白、免疫球蛋白(包括IgG、IgA、IgM)、補體(C3及C4)、淋巴細胞亞群[包括CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、B細胞、NK細胞、CD4+CD25+CD127low調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)]。同時選取了30例體檢結果正常者作為健康對照組(組1)用于比較體液免疫功能相關的數據，另20例體檢結果正常者用于比較淋巴細胞亞群的健康對照組(組2)。所有患兒的血液標本均在開始治療前采集。所采集的血液標本均保存在肝素鈉(1 ∶9)抗凝管中，并在采集后4 h內處理。

1.2 流式細胞術檢測外周血免疫細胞亞群

1.2.1試劑和儀器 異硫氰酸熒光素(FITC)標記的小鼠抗人CD4(克隆號：13B8.2)、CD20(克隆號：L26)，藻紅蛋白(PE)標記的CD8(克隆號：B9.11)、CD19(克隆號：J3.119)、CD16+56(克隆號：3G8)、CD25單抗(克隆號：B1.49.9)、CDl27單抗(克隆號：R34.34)，葉綠素蛋白偶聯物(PC5)標記的CD3(克隆號：UCHT1)、CD45(克隆號：J.33)、CD4單抗(克隆號：13B8.2)及各自對應的同型陰性對照試劑購自美國Beckman-Coulter公司；溶血劑為去離子蒸餾水配制的0.83%氯化銨溶液，由本實驗室自行配置；流式細胞儀型號為FC500-MCL，購自美國Beckman-Coulter公司。實驗數據應用CXP系統進行分析。

1.2.2步驟 ① 采集靜脈血2～3 ml，應用肝素抗凝管，室溫下放置，4 h內檢測。② 將抗凝血100 μl分別加入4只12 mm×75 mm試管，然后1管加入CD4-FITC、CD8-PE及CD3-PC5單抗各10 μl，第1只加入CD19-PE、CD20-FITC及CD45-PC5各10 μl，第2只加入CD3-PC5及CD16+56-PE各10 μl，第3只加入CD4-PC5、CD25-FITC及CD127-PE各10 μl，第4只加入同型對照10 μl。③ 混勻，室溫下避光反應15 min，然后加入1 ml溶血劑并置于37 ℃水浴箱10 min，完全溶血后上機檢測。檢測前調節流式細胞儀光流路質量調控和熒光補償。檢測時首先對淋巴細胞群進行設門，依據前向(FSC)和側向(SSC)散射光信號。每份標本獲取設門內細胞不少于10 000，并保存數據進行分析。

2 結果

2.1 入組患者一般臨床資料共51例初診ITP患兒入組，其中45例(88.2%)患兒有皮膚瘀點瘀斑、牙齦或消化道出血等出血性癥狀。初診組血小板計數較健康對照組明顯降低。所有患兒的年齡、性別與健康對照組比較差異均無顯著性，見表1。

2.2 初診ITP患者的免疫球蛋白及補體水平同時比較了初診ITP與健康對照組(組1)與體液免疫功能相關的實驗室指標，結果發現，ITP組血清IgG水平較健康對照組明顯升高[(16.70±8.19)vs(9.65±3.08)]，差異具有統計學意義(P<0.001)。而IgA、IgM及補體C3、C4差異無顯著性，見表2。

2.3 初診ITP患者的細胞免疫功能為了分析初診ITP患者細胞免疫功能，進一步分析外周血淋巴細胞亞群，結果發現：① ITP組CD4+T細胞及CD8+T細胞與健康對照組均有明顯差異[CD4+T細胞：(30.91±8.23)vs(38.25±6.39)，P=0.003；CD8+T細胞：(34.53±4.73)vs(31.44±4.46)，P=0.037]，CD4/CD8比值明顯低于健康對照組[(0.92±0.29)vs(1.24±0.27)]，差異有統計學意義(P=0.001)；② ITP組B細胞水平明顯高于健康對照組[(8.85±5.53)vs(4.28±1.91)，P=0.001)]，NK細胞水平明顯低于健康對照組[(9.30±4.97)vs(13.37±5.72)，P=0.020)]；③ ITP組CD4+Treg細胞水平明顯低于健康對照組[(4.14±1.69)vs(5.47±0.94)，P=0.004]，見表3。

表1 初診ITP組與健康對照組一般臨床資料比較

t1、P1：初診ITP組與健康對照組1比較；t2、P2：初診ITP組與健康對照組2比較

表2 初診ITP與健康對照組體液 免疫功能相關指標水平

表3 初診ITP與健康對照組細胞免疫功能相關指標水平

※為占淋巴細胞門；△為占 CD3+T細胞門；○為占CD4+T 細胞門

3 討論

目前ITP的治療已有標準的診療指南作為指導，但仍有相當一部分患者對一線治療藥物無效或治療有效后復發。ITP的發病機制十分復雜，目前并沒有統一的認識。許多研究發現免疫異常與ITP的發病密切相關，因此進一步分析ITP患兒初診時的細胞及體液免疫對于研究ITP的發病機制都具有重要意義。本研究分析了51例初診的ITP患兒的體液免疫及細胞免疫相關指標水平，證實了這些患兒體內確實同時存在著細胞及體液免疫異常。目前已有許多研究對ITP患者T細胞亞群水平進行了報道，El-Rashedi et al[6]發現CD4/CD8比值降低和CD8+T細胞比例升高，Koyanagi et al[7]發現CD4/CD8比值與健康人無統計學差異。本研究表明CD4/CD8比值在初診ITP患兒外周血較正常人明顯降低，提示CD8+T細胞在ITP的發病機制中可能發揮重要作用。有研究[8]也證實，在抗血小板抗體陰性的患者體內可檢測到CD8+T細胞介導血小板裂解的作用明顯高于健康對照組，在已緩解的ITP患者體內CD8+T細胞介導血小板裂解的作用與健康對照組卻無明顯差異。總之，ITP患者體內確實存在著免疫紊亂，但CD4+及CD8+T細胞為兩大類細胞群，均包含許多不同表型及功能的細胞亞群，僅依靠CD4/CD8比值不足以反映ITP患者的免疫狀態。這也可能是不同研究所報道的結果不一致的原因。

NK細胞是人體固有免疫細胞，它同樣參與了ITP的發病，主要通過調節B細胞分泌抗體。目前關于NK細胞在ITP中研究的文獻較少且結論并不統一，有研究[9]顯示ITP患者外周血循環NK細胞的比例正常但功能下調，本研究表明，初診ITP患兒的NK細胞比例較健康對照組明顯降低。本研究結果與Talaat et al[10]、El-Rashedi et al[6]的結果相符。

B細胞同樣與ITP的發病密切相關。早期有學者將ITP患者的血清輸注到健康志愿者體內，后來這些患者發生血小板計數明顯下降，隨后的研究發現抗血小板抗體IgG在其中發揮主要作用。抗血小板抗體通過結合血小板表面糖蛋白或小板表面糖蛋白復合物，或通過調節補體的細胞毒作用等方式溶解血小板[11]。本研究也表明，ITP患兒B細胞水平及IgG水平明顯升高，提示體液免疫異常同樣與ITP的發病密切相關。正因為B細胞參與了ITP的發病，目前臨床上已應用利妥昔單抗靶向清除B細胞來治療ITP，且取得了一定的療效。

Treg是一類具有免疫無能和免疫抑制功能的細胞群，在自身免疫性疾病中發揮重要作用[12]。Yu et al[13]發現ITP患者的Treg水平與健康對照組無統計學差異，但許多研究[14-15]都證實ITP患者存在Treg細胞水平或功能的下調，這與本研究結果一致。Treg細胞發揮免疫抑制作用的機制尚不明確，目前認為主要包括以下幾個方面。① Treg細胞可通過分泌免疫抑制因子發揮免疫抑制作用，如TGF-β、IL-10和IL-35；② Treg細胞通過分泌穿孔素和顆粒酶對活化的效應器T細胞產生直接的細胞毒性；③ Treg細胞通過細胞表面免疫抑制分子使效應T細胞失活，如細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CTLA4)和Fas配體；④ Treg細胞與CD4+T細胞競爭與抗原呈遞細胞的相互作用。