自噬相關蛋白Beclin1及IL-18與急性胰腺炎疾病程度的相關性

黃 野，李紅昌，畢禮明，陳亞峰，高 磊，潘麗蕓，孫文杰，劉 歡，李 劼，奉典旭

關于急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)的實驗性研究[1-5]表明AP的發生發展與自噬密切相關。自噬相關蛋白Beclin1在自噬過程中起到重要的調控作用[6]。AP治療領域的研究顯示，炎癥水平與AP的嚴重程度密切相關，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-18(interleukin-18,IL-18)等促炎癥細胞因子是AP從局部免疫反應發展到全身炎癥反應綜合征并最終導致死亡的關鍵因素，IL-18的水平在一定程度上可以代表疾病的炎癥程度[7]。

該研究隨機收集AP患者，分別為輕型急性胰腺炎(mild acute pancreatitis, MAP)、重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)以及健康人作為對照。各組留取血液，檢測血清淀粉酶((amylase, Amy)、Beclin1及IL-18，同時進行改良CT嚴重指數評分(modified CT severity index，MCTSI)、急性生理與慢性健康評分(acute physiology and chronic health evaluation,APACHE-Ⅱ)，探討AP發病時血清Beclin1與IL-18水平以及疾病嚴重程度關系。

1 材料與方法

1.1 病例資料

1.1.1資料來源 本研究入組者患者，共30例，其中MAP患者10例，SAP患者10例，正常對照10例。入組者采集時間：2013年10月～2015年12月。

1.1.2AP入組標準 參考中華醫學會外科分會胰腺外科學組《急性胰腺炎診治指南(2014)》。符合以下3項特征中的2項可診斷為AP：腹痛 (急性、突發、持續、劇烈的上腹部疼痛，常向背部放射)；血清Amy和(或)脂肪酶活性至少高于正常上限值3 倍；增強電子計算機斷層掃描(computed tomography，CT)/磁共振成像或腹部超聲呈AP影像學改變。

本研究入組的AP患者同時符合以下條件：患者發病24 h內進入本研究機構；患者年齡為18～70(43.36±6.32)歲；既往無嚴重的心、腦、肺、腎、肝等基礎疾病。① MAP診斷標準符合AP診斷，不伴有器官功能衰竭及局部或全身并發癥。② SAP診斷標準符合AP診斷，有器官功能衰竭，或存在局部或全身并發癥。

1.1.3主要的試劑及儀器設備 Beclin1 ELISA檢測試劑盒、IL-18 ELISA檢測試劑盒購自武漢優爾生(USCN)科技股份有限公司；離心機(Centrifuge 5810)購自德國Eppendorf公司；超低溫冰箱(MDF-382E) 購自日本Sanyo公司；64排螺旋CT購自德國西門子公司；自動生化檢測儀(INTEGRA 400) 購自上海Cobas公司。

1.2 研究方法

1.2.1研究分組 在符合入組標準的前提下，通過隨機數字表法進行分組：① 對照組(Ctr)：無任何基礎疾病的健康者。② MAP組：患者符合上述MAP入組標準。③ SAP組：患者符合上述SAP入組標準。

1.2.2標本采集 各組留取靜脈血5 ml，AP患者血液系入院后留取，保證在發病24 h內。采集的血液標本常溫下靜置2 h，高速離心機4 ℃下以3 000 r/min離心15 min，取上清液，分裝入EP管中，放置入﹣80 ℃冰箱內保存。用于檢測血清Amy、Beclin1及活性氧(reactive oxygen species，ROS)。

拷貝AP患者入院24 h內腹部增強CT圖片，用于進行腹部CT評分。

1.3 指標檢測

1.3.1Amy測定 經本院檢驗科全自動生化分析儀測定。

1.3.2血清Beclin1測定 采用雙抗夾心酶聯免疫吸附(ELISA)法，具體操作步驟按試劑盒說明書逐步進行。

1.3.3血清ROS含量測定 ROS的檢測也是采用ELISA試劑盒，具體操作同血清Beclin1的測定方法相同。

1.3.4腹部CT評分 腹部CT評分采用改良的CT嚴重指數評分(MCTSI)標準，見表1。

表1 MCTSI(修正CT嚴重指數)評分

MCTSI總分=①+②+③

1.3.5APACHE II評分 根據APACHE II評分表各項檢測指標進行評分。APACHE II評分表包含年齡指數、急性生理學評分、慢性健康指數三部分，三部分評分相加分數，反應全身癥狀，分數越高，病情越嚴重。

2 結果

2.1 血清Amy、Beclin1、IL-18濃度與Ctr組相比，MAP組和SAP組血清Amy、Beclin1、IL-18濃度均升高(P<0.01)；MAP組與SAP組相比，血清Amy、Beclin1、IL-18濃度差異有統計學意義(P<0.01)。見表2、圖1。

2.2 腹部CT及MCTSI、APACHE-Ⅱ評分正常對照者CT輪廓光滑，密度均勻，胰腺周邊無滲出，見圖2A；MAP患者CT提示胰腺體積輕度增大，胰腺周圍脂肪間隙模糊，見圖2B；SAP患者CT提示胰腺密度降低，結構紊亂，胰腺周圍滲出液明顯，多累及腹腔和腹膜后間隙，范圍廣泛，見圖2C。

Ctr組MCTSI、APACHE-Ⅱ評分基本為零，AP發病時MCTSI、APACHE-Ⅱ增高，MAP和SAP與Ctr相比，MCTSI、APACHE-Ⅱ評分增高；并且SAP患者MCTSI、APACHE-Ⅱ評分較MAP患者升高。見表3、圖3。

表2 血清Amy、Beclin1、IL-18濃度

與Ctr組比較：**P<0.01；與MAP組比較：##P<0.01

圖1 血清Amy、Beclin1、IL-18濃度變化與Ctr組比較：**P<0.01；與MAP組比較：##P<0.01

圖2 不同組腹部CT圖像A：Ctr組CT圖像；B：MAP患者CT圖像；C：SAP患者CT圖像表3 各組MCTSI、APACHE-Ⅱ評分比較

評分項目Ctr組MAP組SAP組F值腹部CT評分0.060±0.0132.409±0.346??6.862±0.877??##279.4APACHE II評分0.571±0.7874.571±1.134??9.286±1.113??##127.1

與Ctr組比較：**P<0.01；與MAP組比較：##P<0.01

圖3 MCTSI、APACHE-Ⅱ評分變化與Ctr組比較：**P<0.01；與MAP組比較：##P<0.01

2.3 血清Beclin1與IL-18濃度的相關性血清Beclin1濃度與血清IL-18濃度做直線相關回歸分析可得出y=3 821.960 7x+104.304 5，相關系數為r=0.918 9，P<0.01，提示血清Beclin1與IL-18濃度相關。見圖4。

圖4 血清Beclin1與IL-18相關性分析

2.4 血清Beclin濃度與MCTSI、APACHE-Ⅱ評分的相關性分析血清Beclin1濃度與MCTSI、APACHE-Ⅱ評分做直線相關回歸分析可得出y=10.611 2x-0.596、y=12.980 6x+0.263，相關系數為r=0.977 1、r=0.926 0，P<0.01，提示血清Beclin1濃度與MCTSI、APACHE-Ⅱ評分相關。見圖5。

圖5 血清Beclin1與MCTSI、APACHE-Ⅱ評分相關性分析

3 討論

AP臨床上起病急、變化快、并發癥多，死亡率高，一直是臨床上治療的難點和挑戰，及時、準確、高效地對AP患者進行合理診治尤為重要[8]。明確AP的發病機制是提高其治愈率的根本，大多數研究[9]認為其病理基礎系胰蛋白酶原在胰腺細胞內非正常的激活，從而引起胰腺的自我消化，進一步引起局部及全身炎癥反應。但胰腺細胞內的酶原具體是如何激活的，目前尚不完全清楚，AP時自噬的改變則是近年新的研究熱點。自噬相關信號轉導通路錯綜復雜，自噬相關蛋白Beclin1對自噬的發生和發展有著重要的調節作用[10-11]。正常細胞的生命活動過程中，自噬活動可通過吞噬清除炎性小體的免疫學作用、活性氧以及抑制炎性因子的激活等多個方面進而抑制炎癥反應的產生與發展[12]。然而在AP中，自噬受損，炎癥因子無法及時清除，進一步引起胰腺細胞受損[13]。其中，炎癥因子IL-18與AP的病情進展密切相關[7]。

Mareninova et al[4]通過對分離胰腺細胞、動物模型和人體組織的研究，發現AP時自噬量受損，胰腺腺泡內大量異常自噬空泡堆積；自噬的異常增多是導致酶原激活的誘因，他們認為自噬的病理性改變導致胰腺腺泡細胞空泡的形成以及酶原的激活，最終誘發了AP 的形成。Beclin1是自噬調控的重要分子機制之一，Beclin1的表達和自噬相互促進，血清Beclin1水平的增高可以間接反映AP時自噬的過度激活。這也對臨床治療AP有一定的啟示，或許可以通過減少自噬相關蛋白Beclin1的表達而抑制胰腺腺泡細胞自噬的發生，從而減少胰蛋白酶原的激活以及急性胰腺炎時胰腺組織水腫、出血及壞死的發生。

本研究顯示，AP患者發病早期血清自噬相關蛋白Beclin1水平升高，并且SAP較MAP血清Beclin1水平增高更明顯；Beclin1是自噬形成調控的主要因子之一，這也提示AP的早期伴隨著自噬的積聚增多。AP發病時，IL-18產生增多，并且血清Beclin1與IL-18濃度存在有相關性。本研究結果也表明，AP患者MCTSI、APACHE-Ⅱ評分升高較為明顯，并在一定程度上能反映疾病的嚴重程度；在對血清Beclin1濃度和MCTSI、APACHE-Ⅱ評分進行相關性分析，發現二者有相關性。

綜上所述，本實驗結果提示：AP患者發病早期，炎癥水平升高，炎癥因子血清IL-18與血清Beclin1水平正相關，并且血清Beclin1水平與疾病嚴重程度指標MCTSI、APACHE-Ⅱ評分成正相關，因此對血清Beclin1水平的檢測可能是評估預測AP嚴重程度的一個較為有效的指標。在本次實驗的基礎上，進一步明確二者之間具體關系，可能會為評估預測AP嚴重程度，提供更為有力的證據。