冠心病EAT中miR-455b-3p調控脂肪細胞分化及炎癥因子

杜雅彥，劉 洋，盧 沐，懷施濤，呂作利，魏育濤

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary artery disease，CAD)是歐洲發達國家導致死亡的主要因素[1]。隨著經濟增長，發展中國家的心血管疾病數量也在增加。心外膜脂肪組織(epicardial adipose tissue，EAT)是一種沉積在心肌表面獨特的內臟脂肪組織[2]，能分泌脂聯素(adiponectin，APN，ADIPOQ)等脂肪細胞因子，可能會對心臟功能產生影響，但EAT啟動炎癥發生的機制并不十分明確。微小RNA(microRNA, miRNA)是一類大小約22個核苷酸的單鏈非編碼RNA[3]，通過與靶基因互補位點結合的方式來調控基因表達，調控多種疾病發生和發展。miRNAs在CAD發病機制的各個環節中都有作用，但其對CAD發生發展的具體機制尚不明確。該實驗通過芯片篩選結果顯示，在CAD 患者EAT中，miR-455b-3p高表達。生物信息學預測，miR-455b-3p與APN靶向結合。該研究以miR-455b-3p為切入點，探討miR-455b-3p對脂肪細胞分化及脂肪細胞因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2016年3月～2017年6月在石河子大學醫學院附屬第一醫院心胸外二科行冠狀動脈旁路移植術的CAD患者34例作為實驗組，對照組為行瓣膜置換術的非冠心病(non-CAD)患者16例。手術前收集所有研究對象的一般資料和化驗檢查資料。實驗組符合CAD的診斷標準及納入標準。對照組冠狀動脈造影陰性，需行瓣膜置換手術(瓣膜為退行性變)且符合納入標準。本研究通過新疆石河子大學醫學院附屬第一醫院倫理委員會批準(編號：2014-072-01)，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 主要試劑3T3-L1前體脂肪細胞(中科院上海細胞庫)；引物及內參(上海生工公司)；miRNA模擬物及抑制物(上海吉瑪制藥公司)；RNA提取試劑和 qRT-PCR反應試劑盒(日本TaKaRa公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；DMEM培養基及胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；TRIzol、LipofectamineTM2000轉染試劑(美國Invitrogen公司)；miRNeasy miRNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)；Thermo Scientific miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA熒光定量檢測試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1診斷標準 參照我國衛生部發布的《冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的診斷標準》(2010年版)以及2011年美國心臟聯合會(American Heart Association，AHA)冠心病診療指南。

1.3.2納入標準 實驗組：① 年齡40～75(63.8±4.2)歲；② 符合CAD的診斷標準需行冠狀動脈旁路移植術患者；③ 民族為漢族。對照組：① 年齡40～75(66.5±7.3)歲；② 冠狀動脈造影陰性且需行瓣膜置換手術(瓣膜為退行性變)患者；③ 民族為漢族。

1.3.3排除標準 ① 合并有糖尿病或糖耐量異常者；② 其他類型心臟病，如風濕性心臟病患者；③ 患有惡性腫瘤者；④ 近期有創傷、外科手術者；⑤ 急、慢性感染者；⑥ 長期肝、腎等臟器疾病及其他內分泌疾病。

1.3.4收集臨床資料 包括患者年齡、性別、身高、體質量、病程、大生化、心肌酶、超敏C反應蛋白、心臟彩超及頸動脈彩超等。

1.3.5標本采集 留取手術當天空腹臥位肘靜脈血5 ml，留取血清-80 ℃冰箱保存。開胸后獲取右室表面EAT約1 g，0.9%氯化鈉溶液清洗并去除結締組織后置于液氮中保存。在所有收集實驗組及對照組標本中各挑選5例患者的EAT用于miRNA芯片檢測，由上海伯豪生物芯片技術有限公司技術人員完成Agilent miRNA芯片檢測。[Agilent human miRNA(8*60 K)V18.0 Design ID：70156]同步取患者循環血約5 ml，3 000 r/min離心10 min，取上層血漿至無酶EP管中，并置于-80 ℃冰箱中暫時凍存。

1.3.6EAT標本基因芯片檢測 ① RNA抽提和純化：采用mirVanaTMPARISTM標準操作流程進行樣品總RNA抽提，抽提所得total RNA經電泳質檢合格后備用；② RNA的標記：標本RNA按照 miRNA Complete Labeling and Hyb Kit標準操作流程對miRNA分子進行熒光標記；③ 芯片雜交：按照miRNA Complete Labeling and Hyb Kit進行標本雜交實驗。在滾動雜交爐中，55 ℃，20 r/min，滾動雜交20 h之后在洗缸中洗片；④ 芯片掃描：芯片結果采用Agilent Microarray Scanner進行掃描，軟件設置Scan resolution=5 μm，PMT 100%，5%最后采用 Gene Spring Software 11.0 進行歸一化處理，所用的算法為Quantile；⑤ 差異表達：CAD組和non-CAD組間差異表達的miRNAs采用SAS 系統進行篩選[設定篩選閾值P<0.05，差異倍數值(fold change)>2且Flag值/Call值為至少一組內不出現A(Absent:表示差異無統計學意義) ]。

1.3.7細胞培養與誘導分化 在6孔板中將3T3-L1前脂肪細胞接種于含有10%FBS的高糖DMEM培養液，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞生長至80%～90%并接觸抑制2 d退出對數增長期后，更換為終濃度為0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、5 μg/ml胰島素(INS)和1 μmol/L地塞米松(DEX)的細胞分化誘導液誘導2 d后，再更換含有55 μg/ml INS的維持培養基繼續培養2 d，隔2 d更換含10%FBS的DMEM培養液。分化 8 d 后使用油紅O染色鑒定誘導效率。

1.3.8細胞的轉染 誘導成功的細胞待細胞密度達70%～80%時進行轉染。用Opti-MEM稀釋模擬物、抑制劑以及陰性對照組，并分別與轉染試劑脂質體Lipofectmine 2000按2 ∶1混合均勻，室溫放置20 min，使其形成穩定的復合物。再將復合物加入6孔板中，混勻，將6孔板置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中繼續培養，24 h后收取細胞，空白處理作陰性對照。實驗分為3組：上調組、下調組和NC組。脂肪細胞因子脂聯素(adiponectin，APN，ADIPOQ)、Krüppel樣因子4(Krüppel-like factors, KLF4)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、單核細胞趨化因子1 (monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、CCAAT /增強子結合蛋白α(C/EBPα)和過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPARγ)總RNA提取后使用核酸定量分析儀分析RNA純度。合格的RNA反轉錄為cDNA。使用Step One熒光定量PCR儀(美國ABI公司)進行PCR反應。

1.3.9RNA提取及實時熒光PCR檢測 提取總RNA、反轉錄按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit細胞及組織RNA提取試劑盒及PrimeScriptTMRT reagent Kit with Gdna Eraser試劑盒說明書進行操作。Real-time PCR按照TB GreenTMPremic Ex TaqTMⅡ說明書操作。以U6為內參基因，用2-ΔΔCt的方法表示miR-455b-3p相對于內參基因的定量。引物序列見表1。

表1 實驗相關引物序列

2 結果

2.1 患者的基本信息34例患者的基本臨床信息見表2。其中，與對照組比較，實驗組患者低密度脂蛋白和超敏C反應蛋白升高，高密度脂蛋白和APN降低，差異有統計學意義。

表2 患者的基本信息

2.2 實驗組與對照組配對比較圖1為使用散點圖顯示兩組之間倍數變化和顯著性之間的關系。Y軸是-log10(P值)(較高的值表示較大的顯著性)，并且X軸是倍數變化，即log2(miRNAs的表達量)。確定為顯著的探針在polt上標記(FDRt檢驗<0.05)。圖中的紅點表示差異有統計學意義的miRNA。

圖1 實驗組與對照組配對比較的散點圖

2.3 miRNA芯片篩選出的DE-miRNAs熱圖結果圖2為CAD(n=4)與對照(n=3)中差異表達的miRNA的分層聚類(差異有統計學意義，P<0.05和差異倍數>2倍)。Columns顯示EAT樣品的聚類，行顯示基因的聚類。每個樣品中每種miRNA的表達強度從紅色變為綠色，這分別表示相對高或低的表達。在圖的側面描繪了代表上調至下調的不同模式的表達簇。

2.4 實驗組和對照組EAT及血清中miR-455b-3p表達水平qRT-PCR驗證結果顯示，與對照組比較，miR-455b-3p在實驗組EAT組織和血清中表達均上調，差異有統計學意義，見圖3。

2.5 miR-455b-3p與APN和FABP4 3′非翻譯區(3′-UTR)互補結合位點選取PicTar(http://pictar.org/)、miRGen(http://www.diana.pcbi.upenn.edu/miRGen.html)、TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_50//)、miRWalk(http://www.microrna.org/microrna/)和miRDB(http：// mirdb.org / miRDB /)四個預測網站進行。為了減少軟件預測的假陽性，取至少同時滿足2個預測軟件的基因才能作為靶基因。圖4為預測出的結合位點。

2.6 miR-455b-3p表達譜3T3-L1前脂肪細胞誘導8 d后使用油紅O染色鑒定誘導效率(圖5)。3T3-L1前脂肪細胞經過雞尾酒法誘導后分別于誘導0、2、4、6、8 d檢測miR-455b-3p的表達(圖6A)。

圖2 差異miRNA分層聚類熱圖

圖3 實驗組與對照組EAT和血清中miR-455b-3p表達水平A：EAT中miR-455b-3p表達水平；B：血清中miR-455b-3p表達水平；1：實驗組； 2：對照組；與對照組比較：*P<0.05,**P<0.01

圖4 miR-455b-3p與APN 3′-UTR結合位點

圖5 誘導8 d后油紅O染色 ×200A： 3T3-L1前脂肪細胞；B：油紅O染色結果

2.7 miR-455b-3p對APN及脂肪細胞因子表達影響分別在脂肪細胞誘導分化成熟0、2、4、6、8 d時檢測miR-455b-3p在3T3-L1細胞中的表達，結果顯示miR-455b-3p呈先增多后減少并在8 d時達到最高的趨勢(圖6A)；miR-455b-3p轉染的3T3-L1細胞在轉染后2 d通過qRT-PCR檢測，結果顯示，miR-455b-3p表達為轉染前約15倍(圖6B)。對已誘導成熟的3T3-L1脂肪細胞轉染miR-455b-3p模擬物，與NC組比較，上調組3T3-L1脂肪細胞中APN、KLF4 mRNA表達減少，IL-6、MCP-1 mRNA表達增多，差異有統計學意義(圖7A)；下調組3T3-L1脂肪細胞中APN、KLF4 mRNA表達水平升高，IL-6、MCP-1 mRNA表達減少，差異有統計學意義(圖7B)。

圖6 miR-455b-3p表達譜及轉染效率

A：miR-455b-3p在脂肪細胞分化過程中表達譜；B：miR-455b-3p轉染效率；1：NC組；2：上調組；3：下調組

2.8 miR-455b-3p促進脂肪細胞分化成熟如油紅O染色(圖8)所示，與NC組比較，上調組分化第8天時在脂滴積累較對照組增多，脂肪形成標記基因PPARγ、C/EBPα的mRNA表達水平升高(圖9)。

3 討論

21世紀以來，冠心病是歐洲、美國以及亞洲國家導致死亡的最主要原因，占世界死亡人數的近三分之一。CAD的發生發展與脂代謝紊亂密切相關。EAT是一種位于心肌和心包臟層之間獨特的內臟脂肪組織，EAT和心肌具有相同的微循環，這表明這兩種結構之間有緊密的相互作用[4]。研究[5]表明EAT厚度是CAD獨立危險因素，其厚度和代謝活性與CAD的嚴重程度呈正相關性，在CAD患者中，增厚的EAT可能通過分泌促炎性細胞因子和其他機制促進斑塊的發展。

圖7 miR-455b-3p對脂肪細胞因子表達影響

A：上調組脂肪細胞因子的表達量；B：下調組脂肪細胞因子的表達量； 1：APN；2：KLF4；3：IL-6；4：MCP-1；與NC組比較：*P<0.05

圖8 雞尾酒法誘導3T3-L1前脂肪細胞8 d后油紅O染色鑒定 ×100A：3T3-L1前脂肪細胞；B：上調組油紅O染色結果

APN是一種脂肪細胞因子，對不同類型細胞具有提高胰島素敏感性、抗脂毒性、抗凋亡和抗炎作用，被認為是具有保護作用的生物活性蛋白質[6]。APN通過直接影響血管成分細胞(包括巨噬細胞、內皮細胞和平滑肌細胞)的行為來預防動脈粥樣硬化進展。本研究顯示，CAD患者EAT中高表達的miR-455b-3p靶向調控APN表達。因此以miR-455b-3p為切入點，觀察其對APN的調控、對脂肪細胞因子表達以及對脂肪細胞分化的影響。

圖9 miR-455b-3p對脂肪標志基因影響

A：上調組脂肪分化標志物的表達量；B：下調組脂肪分化標志物的表達量；1：PPARγ；2：C/EBPα；3：FABP4；與NC組比較：*P<0.05

miRNAs是一種具有調節功能的RNA，通過與對應的靶信使RNA(mRNA)特異性結合來直接降解靶mRNA，從而抑制靶mRNA的翻譯，進行基因的轉錄后水平調控[7]。miRNAs在脂肪組織中表達有差異，因此被認為是代謝紊亂、CAD、2型糖尿病的診斷和治療潛在生物學標志物[8]。近年來，人們對miRNA在脂肪細胞發育和肥胖的研究越來越深入[9]。研究[10]顯示miR-183通過靶向Smad4級聯調節PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c和FAS，從而促進脂肪細胞分化。最近研究[11]表明，將miR-17-5p抑制劑尾靜脈注入動脈粥樣硬化小鼠體內后，動脈血管組織中的炎癥反應和氧化應激水平有所降低。本研究顯示，CAD患者的EAT和血清中miR-455b-3p高表達，高表達的miR-455b-3p可能通過調控APN和FABP4，從而引起脂代謝紊亂和炎癥，并且促進脂肪細胞分化成熟。

肥胖既是心血管疾病的獨立危險因素，也與其他幾種危險因素密切相關。脂肪細胞分化與人體肥胖的發生密切相關。脂肪分化過程由幾種轉錄因子組成的調控網絡進行高度程序化調控，包括CCAAT /增強子結合蛋白(C / EBP)基因家族和過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPARγ)[12], 在這些因子中，最主要的是PPARγ和C/EBPα。

動脈粥樣硬化是動脈血流中內皮層紊亂、單核細胞遷移至血管壁并分化為巨噬細胞及泡沫細胞的炎性反應[13]。KLF4是一類具有鋅指結構的轉錄因子，KLF4能夠激活IL-10基因的表達，起到抗炎作用[14]。IL-6主要通過其介導的信號通路促進炎癥反應，是一種目前已知的炎癥因子[15]。MCP-1也稱為趨化因子(CC基序)配體2(CCL2)，參與炎癥、傷口愈合、纖維化和血管形成過程。

綜上，在冠心病心外膜脂肪組織中，脂代謝紊亂可能間接上調miR-455b-3p表達，而miR-455b-3p靶向調控APN表達，從而影響KLF4、IL-6和MCP-1等脂肪細胞因子分泌，導致其表達紊亂。同時miR-455b-3p能夠促進脂肪細胞分化成熟，促進EAT在心外膜沉積及體積增多，從而引起CAD的發生發展，但其具體機制尚待進一步探究。