表皮生長因子對大鼠睪丸間質干細胞增殖和分化的影響研究

張 磊，紀洵敏，蘇志堅，唐 芮，蒲俏虹，彭拓華，張吉凱

睪丸間質細胞(leydig cell)是哺乳動物睪丸間質中的一種內分泌細胞，具有合成和分泌睪酮的功能，是男性體內雄激素的最主要來源[1]，具有促進胚胎期生殖器官的分化發育、形成和維持男性第二性征，促使精子發生與成熟，激發性欲，維持性功能以及調節人體的新陳代謝(如蛋白質合成、骨骼生長及紅細胞生成等)等極其重要的生理功能[2]。近幾十年來，伴隨著全球老齡化問題的加劇，中老年男性部分性激素缺乏綜合征引起的社會問題日益突出，而傳統的激素治療方法存在嚴重不足，因而迫切需要開發全新的生物相容性高的替代治療方法。在這種形勢下，睪丸間質細胞再生分化的研究逐漸成為時下研究的熱點。

表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)于1962年首次在小鼠的頜下腺中發現[3]。EGF是由53個氨基酸組成的多肽單鏈，分子量為6 045，EGF的生物學效應是通過與其受體(EGFR)結合而發揮作用的。它是一種促細胞分裂劑，能加速核酸和蛋白質的合成,從而促進多種細胞分裂增殖，并影響細胞的分化[4]。近年來，研究顯示EGF與睪丸間質細胞的增殖分化功能存在密切關系[5]，但是缺乏直接的研究證據，由于睪丸間質細胞株和原代睪丸間質細胞存在的缺陷和不足[6]，該研究采用課題組構建的二甲磺基乙烷(ethylene dimethanesulfonate，EDS)處理曲細精管體外培養模型[7]來探討EGF在睪丸間質細胞的再生分化過程中對其增殖和分化的影響，目前國內開展這方面的研究較少，該模型直觀地反映了EGF在睪丸間質干細胞再生增殖分化中的作用，為研究EGF在治療中老年男性部分性激素缺乏綜合征中的功能和作用提供了重要的研究基礎數據和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器SD大鼠(約150 g)購自廣東省實驗動物中心；EDS由中山大學化工學院龐冀燕老師合成；睪酮放射免疫分析藥盒購自北京北方生物技術研究所；EGF購自美國RD公司；胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸鈉(insulin-transferrin-sodium selenium,ITS，I1884)和促黃體生成素(luteinizing hormone，LH，L9773)購自美國Sigma公司；Click-iT?EdU HCS Assays(C10350)購自美國Invitrogen公司；DMEM/F12培養基購自美國Gibco公司；24孔板(3156)購自美國Corning公司；熒光定量PCR儀、熒光染料 SsoAdvacedTMSYBR?Green(172-5261)以及DNA合成試劑盒iScript cDNA Synthesis(170-8890)均購自美國Bio-Rad公司；RNA抽提試劑盒RNeasy?Plus Mini Kit(74134)購自德國QIAGEN公司；本實驗所有引物由華大基因合成。

1.2 方法

1.2.1曲細精管體外模型的構建 參照文獻[8]，雄性SD大鼠實驗前7 d腹腔注射EDS(75 mg/kg)，CO2處死后，將睪丸取出，置于冰冷的D-PBS中，剪除被膜，血管與曲細精管剝離，將曲細精管分離成單根，于DMEM/F12培養基中(0.1% BSA和ITS)34 ℃、5% CO2的條件下培養過夜。

1.2.2細胞增殖實驗 按照1.2.1中的方法提取分離大鼠曲細精管，構建曲細精管體外培養模型。次日，將曲細精管分至24孔板，加入細胞因子處理曲細精管，分組為ITS組(DMEM/F12培養基中加入0.1% BSA和ITS)、LH組(ITS組加入LH，LH終濃度為10 ng/ml)、EGF100組(ITS組加入EGF，EGF終濃度為100 ng/ml)和EGF10組(ITS組加入EGF，EGF終濃度為10 ng/ml)，處理24 h后，Click-iT?EdU HCS Assays試劑盒進行5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU)染色，具體操作說明參照試劑盒說明書。

1.2.3細胞分化實驗 按照1.2.1中的方法提取分離大鼠曲細精管，構建曲細精管體外培養模型。次日，將曲細精管分至24孔板，加入細胞因子處理，EGF的濃度為100 ng/ml、10 ng/ml，LH濃度為10 ng/ml，處理時間為72 h，而后將含有細胞因子的培養基更換為含LH的培養基繼續培養至21 d，每3.5 d更換1次培養基，收集第14天和第21天的培養基上清液待測睪酮，收集第14天和第21天樣品提取RNA，熒光定量PCR檢測睪酮合成通路上相關酶的表達情況，基因引物序列見表1。

表1 各基因的引物序列

1.3 統計學處理使用SPSS 17.0軟件進行分析，多組間比較采用方差分析(ANOVA)，兩組之間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGF對大鼠睪丸間質干細胞促增殖作用EdU染色方法檢測大鼠睪丸間質干細胞的增殖情況，結果見圖1，在經過LH和EGF處理24 h后，在曲細精管的表面出現了大量的紡錘形的、EdU標記的細胞。與ITS組比較，LH組能夠顯著促進睪丸間質細胞的大量增殖(t=10.35，P<0.000 1)，EGF100組能夠顯著促進睪丸間質干細胞的增殖(t=12.61，P<0.01)，而EGF10組雖然也能顯著促進睪丸間質干細胞的增殖(t=6.51，P<0.01)，但是與EGF100組比較，其作用效果明顯要弱。EGF能夠促進睪丸間質干細胞的增殖，并且其作用效果呈現出一定的劑量依賴性。

2.2 EGF對大鼠睪丸間質干細胞促分化作用檢測睪丸間質細胞分化的重要指標-睪酮的分泌情況，從圖2中可以看出，經過3 d的EGF處理后，換為含LH的培養基繼續培養至21 d，與ITS組比較，EGF100組能夠顯著地促進睪酮的產生(t=6.05，P<0.01)，EGF10組也能夠顯著地促進睪酮的產生(t=3.46，P<0.01)，表明EGF能夠誘導睪丸間質干細胞向睪丸間質細胞方向的分化，而LH組則沒有明顯地促進睪酮的產生(t=0.85，P<0.01)。

2.3 睪酮合成過程中幾個關鍵基因的表達情況如圖3所示，EGF誘導3 d后，加入含有1 ng/ml LH的培養基繼續培養11 d，實驗結果顯示，EGF能夠影響幾個基因在mRNA水平的表達。對于Star基因，與ITS組比較，LH組能夠顯著促進Star基因的表達(P=0.000 5)， EGF100組和EGF10組也能顯著促進該基因的表達(P=0.000 6、0.000 5)，并且與LH組比較， EGF100組的誘導表達作用要明顯更強(P=0.000 3)；對于Hsd3b1基因，EGF的誘導表達的作用與Star基因相似，與ITS組比較，LH組、EGF100組和EGF10組均能顯著地促進Hsd3b1基因的表達(P=0.000 1、P<0.000 1、P<0.000 1)，并且與LH組比較， EGF100組的誘導表達作用要更強(P=0.013 3)；位于細胞線粒體上的Cyp11a1基因在睪丸間質細胞的分化是一個非常明顯的標志物，在睪酮合成過程中也是非常重要的一個中間酶，與ITS組比較，EGF100組能夠明顯促進Cyp11a1基因的表達(P<0.000 1)，并且與LH組比較，其誘導表達要明顯更強(P=0.000 2)；作為睪丸間質細胞從睪丸間質祖細胞階段向未成熟睪丸間質細胞階段分化的典型標志物基因Hsd17b3與前幾個基因的表達存在差異，與ITS組比較，EGF100組和EGF10組均沒有明顯的誘導表達作用(P=0.899 0，P=0.361 7)；對于Srd5a1基因，與ITS組比較，EGF100組和EGF10組具有明顯的誘導表達作用(P=0.000 3、P=0.007 1)。

圖1 曲細精管的EdU染色

A：EdU染色×100；B：增殖細胞數的統計分析；a：ITS組；b：LH組；c：EGF100組；d：EGF10組；與ITS組比較：***P<0.001

圖2 曲細精管培養21 d時培養基上清液中睪酮的分泌情況

A：ITS組；b：LH組；c：EGF100組；d：EGF10組；與ITS組比較：*P<0.05,***P<0.001

3 討論

成熟睪丸間質細胞的分化主要包括四個階段：睪丸間質干細胞、睪丸間質祖細胞、未成熟睪丸間質細胞和成熟睪丸間質細胞[9]。研究[10]顯示，從出生后7 d的雄性大鼠睪丸內能夠分離到睪丸間質干細胞，并且這些細胞主要位于曲細精管的表面。在成年大鼠睪丸內，成年的睪丸間質細胞一旦成熟，將不會再增殖分化。然而，當成年睪丸間質細胞被特異性的抑制劑EDS殺死后，新的睪丸間質細胞就會生成[11]。

大量研究[12]顯示EGF能夠顯著地影響睪丸間質細胞分泌睪酮的能力。但是EGF對大鼠睪丸間質干細胞增殖分化的影響少有報道。在本研究所構建的曲細精管體外培養模型中，EGF能夠顯著地促進睪丸間質干細胞分化過程中Star、Hsd3b1、Cyp11a1和Hsd17b3等幾個關鍵基因的表達，表明其具有明顯地促分化作用，這與研究中睪酮的檢測情況是一致的。促增殖作用方面，100 ng/ml和10 ng/ml EGF均能顯著地誘導EdU標記陽性的睪丸間質干細胞的增殖，但是在曲細精管培養體系中，出現增殖的不止睪丸間質干細胞，還包括精原細胞和精細胞系的多種細胞，精原細胞和精細胞系的細胞形態及其所處位置均與睪丸間質干細胞不同。

圖3 睪酮合成通路幾個關鍵酶基因的表達情況

A：Star; B: Cypllal; C:Hsd3β1;D:Hsd17β3;E:Srd5a1;ITS組；b：LH組；c：EGF100組；d：EGF10組；與ITS組比較：**P<0.01，***P<0.001

本研究首次在體外組織培養體系中證實了EGF的直接促增殖和促分化作用，近幾年，許多研究結果也間接證明了EGF對睪丸間質細胞的作用。Pan et al[5]通過運用RT-PCR、Western blot和免疫組化技術研究發現EGF和EGFR在牦牛睪丸的發育精子生成過程中發揮著十分重要的作用；Tamada et al[13]研究發現犬類睪丸中EGF及其受體主要在曲細精管上表達，并且在mRNA水平上隨著年齡的增加EGF受體逐漸減少而EGF沒有顯著變化，表明EGF及其受體在犬類睪丸發育過程中發揮作用；He et al[14]研究顯示，新生的公羊駝睪丸并沒有EGF表達，而到了青春期、性成熟期，睪丸中EGF在生精細胞、支持細胞、間質細胞才有明顯表達；宋衛儒 等[15]研究發現，EGF在食蟹猴睪丸不同發育階段的表達存在差異，以新生猴期最低，而后各個發育時期EGF表達量升高。

綜上所述，利用曲細精管體外培養模型，本研究在mRNA水平和酶學水平均直接證明了EGF對睪丸間質干細胞的作用，這些實驗數據將為治療中老年男性雄激素部分缺乏綜合征(PADAM)提供非常重要的線索，即可將EGF作為治療PADAM的候選藥物，開發生物源性雄激素補充藥物或睪丸間質細胞再生替代等全新的治療方法。