TGF-β1通過調節HMGA1表達抑制人滋養層HTR-8/SVneo細胞侵襲

劉 昕，李鵬云，高峻峻，李愛萍，冷茂東，張琳琳，張 展

子癇前期(pre-ecalmpsia，PE)是以高血壓、蛋白尿為主要表現的一組妊娠期癥候群[1]。研究[2]表明，胎盤發育過程中滋養細胞侵襲能力減弱導致的子宮螺旋動脈重塑不足是PE的主要誘發因素之一。多因素均調節絨毛外滋養層細胞(extravillous trophoblast,EVT)入侵蛻膜和子宮肌層的過程，包括環境因素、細胞因子等。其中轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1) 是一類多功能的細胞因子，通過多種機制影響滋養細胞侵襲能力，導致胎盤發育異常，進而參與PE的發病進程。研究[1]顯示，TGF-β1抑制滋養細胞侵襲，在避免滋養細胞過度浸潤中起到重要作用。

高遷移率族蛋白A1(high mobility group A1，HMGA1)是一種保守的核蛋白，對維持DNA重組、修復及轉錄有重要作用，在EVT中表達顯著。研究[2]表明，TGF-β1在腫瘤細胞中通過調節HMGA1表達，進而調節腫瘤細胞侵襲和遷移。然而TGF-β1通過調節HMGA1進而影響滋養層細胞侵襲尚未見報道。該研究擬進一步探討TGF-β1 調節人滋養層細胞系HTR-8/SVneo細胞表達HMGA1的相關機制，闡明HMGA1在TGF-β1抑制人滋養層細胞系HTR-8/SVneo細胞侵襲過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 主要試劑包括重組人TGF-β1(美國PeproTech公司)；P-Akt抗體、HMGA1抗體、Akt抗體(美國CST公司)；β-actin抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)；Lipofectamine3000 轉染試劑(美國Thermo Fisher公司)；SDS-PAGE試劑(北京康為世紀公司)；Wortmannin(上海碧云天公司)；DMEM培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)；青霉素、鏈霉素(美國Sigma公司)。

1.1.2主要實驗儀器 主要設備包括Forma-311 CO2培養箱(美國Thermo公司)；Sj-CJ-1800Y超凈工作臺(蘇州安泰公司)；DNM-9606酶標儀(北京普朗公司)；JY-SCZ2+垂直電泳儀(北京君意東方公司)；Bio-Rad 化學發光成像系統(美國賽默飛公司)。

1.2 方法

1.2.1HTR-8/SVneo的培養及傳代 用DMEM高糖培養基(10% FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素)培養HTR-8/SVneo細胞。細胞懸浮后置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養箱進行培養。用0.25%胰蛋白酶消化，2～3 d傳代1次。實驗時，選擇對數生長期的HTR-8/SVneo細胞，消化并接種于細胞培養板，接種時每孔細胞濃度為1.0×106，接種后將細胞培養板置于恒溫培養箱孵育24 h。

1.2.2TGF-β1作用不同時間對HTR-8/SVneo細胞中HMGA1表達的影響 采用終濃度為5 ng/ml TGF-β1分別作用HTR-8/SVneo細胞0、6、12、24、36 h，收集細胞后提取蛋白和RNA，采用Real-time PCR和Western blot實驗檢測HMGA1的表達。

Western blot操作步驟如下：用50 μg蛋白按照說明書進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后把蛋白轉移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST洗脫3次，每次5 min。加入HMGA1、P-Akt、β-actin、Akt的一抗(1 ∶2 000)孵育2 h后 4 ℃過夜。次日TBST沖洗3次，每次5 min，再與二抗(1 ∶5 000)室溫作用2 h，TBST沖洗3次，每次5 min，用ECL發光液發光顯色，在自動凝膠成像分析系統成像，使用Image J軟件進行分析。實驗重復3次。

Real-time PCR操作步驟如下：收集細胞后，使用RIPA法提取mRNA,使用 Nanodrop 2000儀器檢測總RNA濃度及純度。根據逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA 后，根據Real-time PCR說明書，將 PCR 反應孔置于ABI7500型熒光定量PCR反應儀進行反應，記錄每個PCR反應孔的CT值(目標擴增產物的熒光信號達到設定閾值所經歷的循環數)，按照 2-ΔΔCt方法計算HMGA1和內參β-actin的熒光定量PCR數據。實驗重復3次。各引物序列見表1。

表1 Real-time PCR的引物序列

1.2.3TGF-β1通過激活PI3K/AKT通路上調HMGA1 將細胞分為：空白對照組、TGF-β1處理組、TGF-β1+Wortmannin處理組、Wortmannin處理組。HTR-8/SVneo細胞無血清饑餓12 h后，在TGF-β1+Wortmannin處理組、Wortmannin處理組中加入PI3K/AKT通路抑制劑Wortmannin(0.1 μmol/L)進行預處理1 h，而后用5 ng/ml TGF-β1加入TGF-β1處理組和TGF-β1+Wortmannin處理組，培養24 h后進行蛋白提取，用Western blot檢測P-Akt、Akt蛋白表達。

1.2.4阻斷PI3K/AKT通路對TGF-β1調節細胞中HMGA1表達的影響 分組同上。依照分組添加或不添加5 ng/ml的TGF-β1和0.1 μmol/L的Wortmannin，采用Western blot法檢測HMGA1的表達。

1.2.5HMGA1參與TGF-β1對人滋養層HTR-8/SVneo細胞侵襲的抑制過程 使用驗證過沉默效率的HMGA1 siRNA用于后續實驗(正義鏈：GCGAAGUGCCAACACCUAATT；反義鏈：UUAGGUGUUGGCACUUCGCTT)，根據實驗目的，將HTR-8/SVneo細胞分為4組：空白對照組、TGF-β1處理組、TGF-β1+siHMGA1組、siHMGA1組。采用Transwell侵襲實驗檢測各組細胞侵襲力的變化。顯微鏡下隨機選取5個視野，觀察轉移至下室內的細胞并拍照。使用Image J軟件分析各組侵襲的細胞數目。

2 結果

2.1 TGF-β1作用不同時間對HMGA1在HTR-8/SVneo中表達的影響為研究TGF-β1對HMGA1表達的影響，用5 ng/ml TGF-β1處理HTR-8/SVneo細胞不同時間。Western blot結果顯示，各時間點HMGA1蛋白水平均增高，而處理24 h后HMGA1蛋白水平顯著增高(F=1.38，P<0.05)。Real-time PCR顯示，5 ng/ml TGF-β1處理24 h后，HMGA1的mRNA水平(3.11±0.08)顯著增高(F=19.02，P<0.05)。見圖1。

2.2 TGF-β1誘導HMGA1上調通過活化PI3K/AKT通路用TGF-β1濃度為5 ng/ml處理或不處理HTR-8/SVneo細胞24 h，使用Wortmannin(0.1 μmol/L)預處理或不處理1 h，用Western blot檢測HTR-8/SVneo細胞PI3K/AKT信號通路的活化情況。結果顯示(圖2)：與空白對照組比較，在HTR-8/SVneo細胞中TGF-β1明顯上調了Akt、P-Akt的蛋白表達水平(F=3.12，P<0.05;F=1.36,P<0.05)。與TGF-β1 組相比，TGF-β1+Wortmannin組中Akt、P-Akt的蛋白表達水平降低(F=1.11,P<0.05；F=1.08,P<0.05)。這說明TGF-β1誘導HMGA1上調通過活化PI3K/AKT信號通路。

圖1 不同時間點的TGF-β1誘導 HTR-8/SVneo后HMGA1蛋白和mRNA的表達A：HMGA1 mRNA; B: HMGA1蛋白表達；與0 h比較：*P<0.05

2.3 阻斷PI3K/AKT通路對TGF-β1調節細胞HMGA1表達的影響Western blot結果顯示(圖3)：5 ng/ml的TGF-β1明顯提高了HTR-8/SVneo細胞HMGA1的蛋白表達水平(F=5.06,P<0.05)，Wortmannin則抑制了TGF-β1對HMGA1的誘導(F=2.25,P<0.05)。說明通路抑制劑Wortmannin阻斷了PI3K/AKT通路，進而抑制了TGF-β1對HMGA1表達的上調作用，即PI3K/AKT信號通路是此過程中的關鍵環節。

2.4 HMGA1參與TGF-β1對人滋養層HTR-8/SVneo 細胞侵襲抑制過程檢查TGF-β1誘導調節HMGA1是否參與TGF-β1對人滋養層細胞的侵襲抑制過程，利用已驗證過沉默效率的HMGA1 siRNA轉入細胞(Sense：GCGAAGUGCCAACACCUAAT,Antisense：UUAGGUGUUGGCACUUCGCTT)。實驗分組如前所述。如圖4所示，TGF-β1處理組發生侵襲的細胞數為(45.20±3.38)，空白對照組發生侵襲細胞數為(106.30±3.62)，TGF-β1+siHMGA1組侵襲

圖2 Western blot檢測TGF-β1和抑制劑Wortmannin單獨 及聯合作用對HTR-8/SVneo細胞Akt、P-Akt蛋白的影響

A：Akt; B: P-Akt；1：空白對照組；2：TGF-β1 處理組；3：TGF-β1 +Wortmannin處理組；4：Wortmannin處理組；與空白對照組比較：*P<0.05；與TGF-β1處理組比較：#P<0.05

圖3 阻斷PI3K/AKT通路對TGF-β1 調節細胞HMGA1蛋白表達的影響

1：空白對照組；2：TGF-β1 處理組；3：TGF-β1 +Wortmannin處理組；4：Wortmannin處理組；與空白對照組比較：*P<0.05；與TGF-β1處理組比較：#P<0.05

細胞數為(75.10±2.91)，siHMGA1處理組為(64.60±4.15)。與空白對照組比較，TGF-β1處理組侵襲細胞數明顯降低，差異有統計學意義(F=10.51，P<0.05)。與TGF-β1處理組比較，TGF-β1+siHMGA1組侵襲細胞數明顯增多，說明HMGA1參與了TGF-β1對人滋養層HTR-8/SVneo細胞侵襲的抑制過程。

圖4 各處理組的侵襲細胞數 結晶紫染色×100

A：空白對照組；B：TGF-β1處理組；C：TGF-β1+siHMGA1處理組；D：siHMGA1處理組；與空白對照組比較：*P<0.05；與TGF-β1處理組比較：#P<0.05

3 討論

PE是一種復雜的全身性血管疾病，增加了懷孕和患嚴重疾病的風險，極其危害母嬰健康[3]。現臨床上以對癥治療為主，但終止妊娠才是唯一有效的治療手段[4]。許多學者認為PE 是一種滋養細胞疾病，因為PE患者胎盤的主要病理特征是滋養細胞浸潤過淺和子宮螺旋動脈重塑障礙[5]。而正常妊娠過程中母體子宮內膜是適當浸潤的。研究[6]顯示滋養細胞侵襲功能的下降與PE密切相關，但相關分子機制尚不明確。

TGF-β是一類多潛能細胞因子超家族，其亞型包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，可以調節細胞分化、增殖、凋亡等重要生物學功能[7]。其中TGF-β1參與滋養細胞的增殖分化，在胚胎著床中起重要作用，可誘導TIMP產生進而抑制滋養細胞浸潤[8]。子宮內膜中TGF-β1主要表達于基質和上皮細胞，滋養層細胞也含豐富的TGF-β1。胎盤中TGF-β1定位于絨毛膜滋養層細胞胞質、蛻膜細胞和絨毛附近區域。未著床的孕胚可分泌TGF-β1受體與TGF-β1結合，因此TGF-β1貫穿了整個妊娠過程，包括著床、子宮螺旋動脈重構、胎盤和胎兒的正常生長[9]。研究[10]顯示，PE組孕婦母體外周血血清和胎盤組織TGF-β1水平顯著高于對照組，可能與PE的發生密切相關。TGF-β1 及其受體通過多種機制引起滋養細胞侵襲不足，影響子宮-胎盤血管床的發育和重塑，導致胎盤缺血低氧，進而參與PE進程。研究[2]表明在甲狀腺癌細胞中，HMGA1影響了TGF-β1 在細胞侵襲過程的作用。而在滋養細胞中，HMGA1是否參與TGF-β1對滋養層細胞侵襲的調節仍不清楚。本研究中，TGF-β1通過上調HMGA1抑制滋養細胞侵襲,有助于了解TGF-β1抑制滋養細胞侵襲的作用機制。本研究表明，5 ng/ml TGF-β1明顯抑制人滋養層細胞HTR-8/SVneo的侵襲性，這與Cheng et al[1]的研究一致。5 ng/ml的TGF-β1通過PI3K/AKT信號通路對HMGA1表達有上調作用，而加入PI3K/AKT信號通路的抑制劑Wortmanin后，TGF-β1對HMGA1的上調作用明顯被抑制，這表明PI3K/AKT信號通路是TGF-β1調節HMGA1表達的橋梁。這與Zu et al[11]在乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞中的研究有相似之處。

HMGA1是高遷移率族蛋白家族中的一員，它通過與位于多種基因的啟動子和增強子區域的A/T豐富DNA序列直接相互作用，參與調控染色質結構[12]。滋養層細胞侵襲不足被認為是PE的發病原因之一，而HMGA1可調節在胎盤形成過程中絨毛外滋養層細胞的遷移，與不充分的滋養細胞入侵有關[13]。而本研究中Transwell實驗顯示，5 ng/ml的TGF-β1明顯抑制了滋養層細胞的侵襲。而用小干擾RNA敲低HMGA1后，減少了TGF-β1對滋養細胞侵襲的抑制作用。這說明HMGA1是TGF-β1抑制滋養細胞侵襲過程的重要環節。然而妊娠中滋養細胞的侵襲與惡性腫瘤的侵襲不同，在時間和空間上受多種因素的綜合調節，空間上限于子宮內膜和子宮肌層的內1/3，時間上限于妊娠早期，從而限制了滋養細胞侵襲的深度，所以TGF-β1/HMGA1對滋養細胞侵襲的調節作用與PE的關系仍需進一步探討。

綜上所述，TGF-β1抑制滋養細胞侵襲，可能導致PE的發生。而TGF-β1抑制滋養細胞侵襲通過上調HMGA1表達。為此，推測通過以TGF-β1/HMGA1為靶點，可為探索PE發病機制及為治療提供新的思路。