IL-1β對華勒變性早期雪旺細胞增殖與凋亡的影響

羅曉荷，陳 剛，王宜梅，王 煒，朱 飛

再生醫學作為極具潛力的新興醫學領域，通過修復、替換或再生器官和組織的方式恢復受損組織的功能[1]。人類具有有限的再生修復組織和器官的能力，當周圍神經損傷后即發生華勒變性(wallerian degeneration,WD)，損傷處殘存的雪旺細胞(schwann cells，SCs)的數量和增殖分化能力是影響神經再生修復的關鍵因素。在此過程中SCs去分化，分泌大量生長因子，促進軸突生長和髓鞘形成，從而促進神經的再生修復[2]。同時，受損的周圍神經系統產生白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和其他炎癥因子，參與一系列免疫應答反應。既往研究[3-4]證明IL-1β在組織再生過程中發揮多種作用。例如促進血管平滑肌的增殖，促進髓核細胞增殖等。由此推斷，除了參與WD中的免疫應答作用，IL-1β對SCs的增殖和凋亡也具有一定影響。該研究將觀察周圍神經系統WD早期IL-1β對SCs增殖和凋亡的影響，并探討其相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 6～8周齡清潔級雄性SD大鼠18只，體質量220～260 g，飼養環境溫度為18～26 ℃，相對濕度為40%～70%，由上海交通大學附屬第九人民醫院中心實驗室提供。

1.1.2主要試劑 胎牛血清FBS、DMEM高糖培養液購自美國Invitrogen公司；三抗(100×青霉素、鏈霉素、兩性霉素B)購自美國GIBCO公司；重組大鼠IL-1β購自美國R&D Systems公司；96孔培養板、6孔培養板、90 mm培養皿、50 ml離心管購自美國BD公司；RIPA裂解液購自連云港碧云天公司；anti-Ki67 antibody、anti-Bax antibody、anti-Bcl-2 antibody購自美國Abcam公司；Tunel法凋亡檢測試劑盒購自美國羅氏公司。

1.1.3主要儀器 儀器：流式細胞儀購自美國BD公司；CO2培養箱購自德國HERAEUS公司；光學顯微鏡購自日本Olympus公司；立體解剖顯微鏡購自日本Carl Zeiss Jena公司；超凈工作臺購自蘇州凈化設備廠；離心機購自上海手術器械公司；酶聯免疫檢測儀購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1體外WD模型的制備 參照Thomson et al[5]于1993年報道的vitroWallerian degeneration制備方法，并根據實驗需要進行了改進所制備的體外WD模型。制備過程：將6～8周齡健康雄性SD大鼠麻醉后處死，75%酒精浸泡消毒，于超凈臺俯臥位固定，暴露坐骨神經全長，切取大鼠坐骨神經全長，立體解剖顯微鏡下去除神經外膜，將神經分成絮狀神經絲，置于含10%胎牛血清FBS和100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素、0.25 mg/ml兩性霉素B的DMEM培養液中，于37 ℃、5%CO2培養箱進行體外培養。

1.2.2免疫熒光染色法檢測增殖標記Ki67表達情況 將去除神經外膜的大鼠坐骨神經組織離體后于體外WD模型中培養，給予不同濃度IL-1β干預(0 ng/ml和5 ng/ml)。干預培養48 h，收集坐骨神經組織樣本，PBS洗滌2次；4%多聚甲醛固定15 min；棄除固定液，PBS洗滌3次；1%BSA封閉液封閉60 min；加入200 μl Ki67一抗(1 ∶100稀釋)4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次；加入熒光標記的二抗，避光37 ℃孵育60 min；PBS洗滌3次；加入DAPI(1 ∶1 000)避光37 ℃孵育60 min，PBS洗滌3次；抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并計數。

1.2.3Tunel法細胞凋亡染色 去除神經外膜的大鼠坐骨神經組織離體后于體外WD模型中培養，給予不同濃度IL-1β干預(0 ng/ml和5 ng/ml)。干預培養48 h，收集坐骨神經組織樣本，PBS洗滌2次；4%多聚甲醛固定15 min；棄除固定液，PBS洗滌3次；用0.1%枸櫞酸鈉緩沖液配0.1%的Triton X-100，冰上孵育2 min；PBS浸泡3次；加入Tunel反應液，37 ℃避光孵育1 h；PBS避光浸泡2次；DAPI染核，37 ℃避光孵育30 s；PBS避光浸泡3次；熒光封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并計數，Tunel試劑標記紅色和DAPI標記的藍色同時陽性才被認為是凋亡細胞。

1.2.4Western blot檢測B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2關聯X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein,Bax)蛋白表達 去除神經外膜的大鼠坐骨神經組織經體外WD模型中不同濃度IL-1β干預(0 ng/ml和5 ng/ml)后24 h收集樣本，提取組織總蛋白，通過BCA法檢測蛋白濃度并調整樣品蛋白濃度后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移到聚偏二氟乙烯PVDF膜，放入5%BSA中封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，顯影儀掃描。

2 結果

2.1 IL-1β對體外WD模型中SCs增殖的影響不同濃度IL-1β干預培養48 h后，免疫熒光標記的Ki67均主要位于細胞核內；5 ng/ml濃度的IL-1β干預后，大鼠坐骨神經組織中SCs Ki67表達量較0 ng/ml濃度組有所升高(圖1)。統計兩組SCs的Ki67陽性率顯示，5 ng/ml濃度組Ki67陽性率較0 ng/ml濃度組升高,差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 不同濃度IL-1β干預后SCs Ki67陽性細胞和凋亡細胞比例

2.2 IL-1β對體外WD模型中SCs凋亡的影響Tunel陽性主要位于細胞核內；5 ng/ml IL-1β干預48 h后，大鼠坐骨神經組織中SCs Tunel表達量較0 ng/ml濃度組有所降低，見圖2。統計兩組SCs的Tunel陽性率顯示，5 ng/ml濃度組Tunel陽性率較0 ng/ml濃度組降低，兩組間差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3 IL-1β對體外WD模型中Bcl-2和Bax蛋白表達情況的影響不同濃度IL-1β干預培養24 h后，用Western blot檢測大鼠坐骨神經組織樣本中Bax和Bcl-2表達量，并以β-actin作為內參。實驗重復3次，分別檢測5 ng/ml濃度組和0 ng/ml濃度組體外WD模型中Bcl-2和Bax表達量，統計分析兩組體外WD模型中Bcl-2和Bax表達量差異，見圖3、表2：5 ng/ml濃度組較0 ng/ml濃度組SCs凋亡抑制蛋白Bcl-2表達量升高(P<0.05)；5 ng/ml濃度組較0 ng/ml濃度組凋亡促進蛋白Bax表達量降低(P<0.05)。這與Tunel法凋亡染色結果一致。進一步統計Bcl-2/Bax比例的差異，分析顯示，5 ng/ml組較0 ng/ml組中SCs凋亡抑制蛋白Bcl-2/凋亡促進蛋白Bax表達量比例升高(P<0.05)。

表2 不同濃度IL-1β干預后SCs中Bcl-2和Bax蛋白表達量及其比值

圖1 不同濃度IL-1β干預48 h后SCs Ki67表達情況 A：免疫熒光染色×100；B：SCs Ki67陽性率;與0 ng/ml組比較：**P<0.01

圖2 不同濃度IL-1β干預48 h后SCs凋亡情況A：免疫熒光染色×100；B：SCs Tunel陽性率；與0 ng/ml組比較：*P<0.05

圖3 不同濃度IL-1β干預24 h后SCs中Bcl-2和Bax蛋白表達情況A：Western blot檢測Bcl-2和Bax蛋白表達； B： Bcl-2；C： Bax; D： Bcl-2/Bax；與0 ng/ml組比較：*P<0.05

3 討論

在周圍神經損傷發生WD的過程中，損傷處殘存的SCs自發去分化和增殖，促進髓鞘形成和軸突再生。同時，受損的周圍神經系統產生的IL-1β等多種炎癥因子在神經損傷修復的過程中發揮重要作用。既往研究[6]表明IL-1β可增加損傷區域SCs神經生長因子的表達量，促進神經元存活及軸突生長，并誘導巨噬細胞清除髓鞘碎片，從而促進周圍神經再生。但IL-1β對SCs增殖和凋亡作用的研究鮮有報道。

Ki67是一種核抗原，作為細胞增殖的特異性和敏感性標志物，是檢測細胞增殖的可靠指標。Ki67在G0期和G1早期無表達，于G1中后期開始表達，位于細胞核周圍區，S期、G2期表達逐漸增加，M期達到峰值[7]。本研究通過免疫熒光染色標記坐骨神經WD早期過程中SCs Ki67，并量化分析IL-1β干預前后其表達的陽性率差異。本研究顯示適當濃度IL-1β干預后SCs Ki67表達量增加，Ki67陽性率升高，可見IL-1β具有促進坐骨神經WD早期SCs增殖的作用。

檢測細胞增殖情況后，本研究進一步采用Tunel法凋亡細胞染色檢測并分析IL-1β干預前后細胞凋亡率差異。結果顯示適當濃度IL-1β可降低坐骨神經WD早期SCs凋亡率，抑制其細胞凋亡。細胞凋亡是由基因調控的細胞自主的程序性死亡。通常，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間的平衡是確定細胞是否經歷凋亡的關鍵點[8]。Bcl-2蛋白家族則在其中扮演著重要角色，根據對細胞凋亡調控作用的不同及同源結構的不同，將Bcl-2蛋白家族分為3個亞組，一組具有抗凋亡作用，其他兩組具有促凋亡作用， Bax和Bcl-2是該家族的主要成員，其在人體細胞中的作用受到廣泛關注[9]。Bax和Bcl-2是同源基因，Bcl-2具有抗細胞凋亡作用。Bax是Bcl-2的拮抗基因，對Bcl-2具有拮抗作用。Bcl-2對細胞凋亡的影響與Bcl-2和Bax比例的變化密切相關，兩者比例的改變決定了凋亡信號刺激后細胞發生凋亡或存活的最終命運[10]。Bcl-2基因可在多種正常細胞的刺激和發育中表達，但在成熟或凋亡細胞中不表達或最低限度表達。研究[11]表明Bcl-2通過多種途徑聯合作用調節細胞凋亡，其機制主要包括：抑制促凋亡細胞色素C從線粒體釋放后進入細胞質；抗氧化作用和維持細胞內鈣離子的平衡；阻止細胞質中的細胞色素C激活caspase，抑制DNA裂解[12]。Bax是一種關鍵的促凋亡蛋白，主要存在于細胞質，發生凋亡時，Bax易位到線粒體膜，形成同源二聚體促進凋亡，當與Bcl-2形成異源二聚體時，凋亡作用則被抑制。

通過Western blot檢測顯示，適當濃度IL-1β干預后WD早期抗凋亡蛋白Bcl-2表達量增加，促凋亡蛋白Bax表達量降低。統計結果顯示適當濃度IL-1β干預后WD早期SCs Bcl-2/Bax表達量比例升高。這與Tunel法凋亡細胞染色結果一致表明適當濃度IL-1β可抑制坐骨神經WD早期SCs的凋亡。

綜上所述，適當濃度的IL-1β可以促進WD早期SCs的增殖，并增加抗凋亡蛋白Bcl-2表達，降低促凋亡蛋白Bax的表達，從而抑制SCs凋亡。該研究對探尋局部組織損傷后炎癥因子對組織再生的作用具有重要意義，為周圍神經再生修復的治療提供理論基礎，值得進一步深入探討。其確切的作用機制是下一步研究的重點。