探索人高轉移胃癌細胞HGC-27適配體的靶標蛋白

劉浩波，劉 濤，王亞雷，羅昭鋒

胃癌(stomach cancer，SC)是世界上第四大常見的惡性腫瘤, 發病率逐年上升[1]，但其早期癥狀并不明顯，大多數SC患者就診時就已發生癌細胞轉移, 延誤了最佳治療時機。因此如果能鑒定出高轉移性SC的腫瘤標志物將對早期監測SC轉移和探索SC轉移機制帶來巨大前景。

目前，尋找腫瘤標志物一種方法是使用抗體，另一種是使用適配體，通過抗體尋找靶蛋白時，需要兩種抗體形成一種特殊結構才能找到靶標蛋白[2]，使用核酸適配體來尋找生物標志物的方法相對簡單。核酸適配體是由隨機寡核苷酸文庫通過寡核苷酸與靶分子的重復結合演化而來的單鏈DNA或RNA分子。與抗體類似，適配體可以以高特異性和親和力結合其靶分子。該研究旨在利用已經得到的可以特異性識別高轉移SC細胞的適配體LW-25去探索其結合的靶標蛋白。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1細胞株 人胃癌細胞系HGC-27(高轉移能力)獲贈于中國科學技術大學生命科學院；生長于含20 U/ml的青霉素和鏈霉素以及10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中，在37 ℃、5%CO2條件下恒溫恒濕培養箱內培養, 實驗均采用對數期細胞。

1.1.2單鏈DNA序列名稱及堿基組成 見表1。

表1 生物素修飾后的LW-25及隨機文庫Lib的堿基組成

以上兩種適配體由上海生物工程公司合成

1.1.3主要試劑和儀器 RMPI-1640培養基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；PBS緩沖液購自上海慧穎生物科技有限公司；青霉素-鏈霉素溶液、PMSF、蛋白酶抑制劑混合物購自上海碧云天公司；酵母tRNA購自美國Sigma公司；葡萄糖、BSA購自上海生物工程公司；洗滌緩沖液(washing buffer，WB)、結合緩沖液(binding buffer，BB)以及DNA封閉液由實驗室自行配置； WB：含有4.5 g/L葡萄糖及5 mmol/L MgCl2的DPBS；BB：含有1 mg/ml BSA和0.1 mg/ml酵母tRNA的WB；DNA封閉液：5 mg鮭魚精DNA和1 ml胎牛血清加入4 ml的BB；鏈霉親和素包被的瓊脂糖凝膠珠、Q Exactive Plus質譜儀購自美國賽默飛公司；Guava easyCyte 5流式細胞儀購自美國Merck Millipore公司；CLM-170B-8-NF型CO2培養箱購自上海Esco公司。

1.2 方法

1.2.1LW-25靶標類型的鑒定 核酸適配體的靶標類型通過胰蛋白酶消化細胞蛋白，然后將細胞與核酸適配體孵育，再用流式細胞儀檢測其結合結果來確定。

1.2.2SC細胞的培養 將HGC-27細胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.2.3收集蛋白樣品 收集2×108的HGC27細胞；洗滌消化后收集在離心管中，將細胞加入含有PBS(pH 7.4)、2%Triton-X-100(V/V)、0.4%SDS(W/V)、5 mmol/L EDTA、1 mmol/L PMSF以及蛋白酶抑制劑混合物的裂解液，于4 ℃、水平搖床上孵育裂解50 min，將細胞裂解液在4 ℃、6 500 r/min離心5 min，保留上清液作為蛋白質樣品。

1.2.4蛋白上樣樣品的制備 通過適配體下拉實驗技術，將適配體LW-25和文庫分別與蛋白質樣品孵育，進而分別與鏈霉親和素包被的瓊脂糖凝膠珠孵育，利用鏈酶親和素和生物素的相互作用，通過高溫變性洗脫LW-25和文庫結合的蛋白質。

具體而言，分別取90 μl瓊脂糖凝膠珠置于3個EP管中并用WB洗滌3次；用5%的BSA封閉珠子1 h，封閉完成后用WB洗滌珠子5次。收集的蛋白質樣品加入DNA封閉液孵育1 h，封閉完取100 μl留作全蛋白樣品組。將封閉后的蛋白質樣品與400 nmol/L的LW-25在4 ℃水平搖床上孵育1 h，離心后的上清液與0.9 mg(90 μl)瓊脂糖凝膠珠在4 ℃振蕩器上孵育1 h，用磁鐵收集已經捕獲蛋白質-LW-25復合物的瓊脂糖凝膠珠；將封閉后的蛋白質樣品與400 nmol/L的Lib在4 ℃搖床上孵育1 h，離心后的上清液繼續與0.9 mg(90 μl)瓊脂糖凝膠珠在4 ℃振蕩器上孵育1 h，用磁鐵收集已經捕獲蛋白質-Lib復合物的瓊脂糖凝膠珠；將封閉的蛋白質樣品直接與0.9 mg(90 μl)瓊脂糖凝膠珠在4 ℃振蕩器上孵育1 h，用磁鐵收集瓊脂糖凝膠珠；收集的珠子用WB洗滌5次。

1.2.5SDS-PAGE 向3組珠子中各加入30 μl 1×上樣緩沖液，向預留的100 μl全蛋白中加入25 μl 5×上樣緩沖液，100 ℃變性10 min。將變性后的蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳后，將其浸入考馬斯亮藍染液中35 min，染色后用超純水脫色，直至條帶清晰可見。用凝膠成像儀掃描SDS-PAGE凝膠以獲得圖像，并分析圖像結果找出差異條帶。

1.2.6質譜檢測差異條帶 切下SDS-PAGE凝膠中的差異條帶并送質譜檢測。

2 結果

2.1 LW-25靶標類型分析先用胰蛋白酶消化細胞，再將消化后的細胞與適配體孵育。未經胰酶處理的細胞與適配體有著很強的結合力，而經胰酶處理的細胞與適配體結合強度明顯下降,說明核酸適配體LW-25的靶標是蛋白質。見圖1。

圖1 LW-25的靶標類型圖

2.2 SDS-PAGE成功檢測到差異條帶在用凝膠電泳掃描儀掃描后，獲得掃描圖，找到差異條帶，即箭頭所指蛋白條帶，差異條帶處可見LW-25組蛋白表達量要明顯高于文庫對照組。空白珠子組在相應位置則無明顯條帶。見圖2。

圖2 考馬斯亮藍染色的10%SDS-PAGE 凝膠圖

1：Marker；2：全蛋白；3：空白珠子樣；4：文庫珠子樣；5：核酸適配體LW-25珠子樣

2.3 液相色譜-質譜聯用儀分析出最明顯的差異蛋白將切下的差異條帶送去質譜檢測，獲得差異條帶中的蛋白信息見圖3。圖中可見不含POU結構域的八聚核苷酸結合蛋白(non-POU domain-containing octamer-binding protein,NONO)在適配體LW-25樣品組中量極高，在文庫對照組中蛋白量很少，在空白珠子對照組中幾乎沒有，并且NONO(54.2 ku)的大小與從SDS-PAGE凝膠上切下條帶的分子量正好相關。

圖3 差異蛋白條帶質譜分析結果

A：LW-25結合的蛋白質；B：文庫結合的蛋白質；C：空白珠子結合的蛋白質；D：NONO的肽指紋圖譜

3 討論

SC是種致命的惡性腫瘤，轉移與侵襲是患者死亡的主要原因。大約有50%患者在SC確診時就已經發生了轉移[3]。因此，早期發現腫瘤并預防其轉移顯得十分重要。特異性指示SC轉移的腫瘤標志物的鑒定，可以實現對SC的早期檢測，還可以深入了解SC的發生和發展機制，進而實現SC的預防和治療。

尋找腫瘤標志物一直是醫師和生物研究人員熱衷的研究方向，如原發性肝癌患者血清中的甲胎蛋白被公認為是肝癌最具診斷價值的診斷指標[4]。然而像甲胎蛋白這種具有重要診斷價值并投入臨床實踐的標志物卻很少，這種現象可以歸因于兩個主要方面：① 缺乏用于腫瘤標志物發現的有效方法；② 缺乏用于腫瘤標志物驗證和應用的實際測定的分子工具。

核酸適配體具有無免疫原性、尺寸小、優異的化學穩定性以及容易生產的特性，能夠通過折疊三維結構以高親和力與靶標特異性結合，并且能在分子水平上區分惡性腫瘤細胞及其相應的正常細胞，在識別分子差異上具有很大優勢[5]。因此，可以把適配體用作探索腫瘤標志物的理想分子探針，進而通過后期的質譜檢測分析出核酸適配體所結合的靶標。此外利用細胞指數富集的配基系統進化技術(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)篩選的適配體可以繼續用于鑒定腫瘤新的標志物[6]。到目前為止，利用細胞SELEX技術篩選出來的適配體已經鑒定出了多種腫瘤標志物，如酪氨酸蛋白激酶7[7]、免疫球蛋白重μ鏈[8]、應激誘導磷蛋白1[9]等。

尋找核酸適配體靶蛋白實驗已存在許多年，但利用此種方法找到的腫瘤標志物卻很少，說明此種方法還存在一些難點有待解決。比如靶蛋白分子量不清楚因而很難鎖定電泳中的靶標所在的條帶。從捕獲蛋白-適配體的磁珠洗去非特異性蛋白時需要適當的洗滌條件，過度的洗滌有可能將靶蛋白一同洗掉，洗滌不足會存留大量的非特異性蛋白，導致質譜結果數據繁多復雜，很難判斷哪個是靶蛋白。本實驗中一些技術環節上的改進，如多次重復實驗以確保結果的可靠性；通過加大細胞量去避免靶標蛋白因濃度過低導致SDS-PAGE檢測不出條帶的問題；在核酸適配體和蛋白孵育時通過加大鹽濃度以促進適配體和靶蛋白的牢固結合，并通過嚴格的洗滌步驟以去除非特異性結合蛋白等。這使得在重復SDS-PAGE時可以穩定的得到相同的差異條帶。

本研究顯示NONO參與了多種腫瘤的發生和發展, 有文獻[10]報道稱在乳腺癌細胞系SKBR3 (HER2/c-erb-2過表達) 中敲除P54nrb/NONO可抑制癌細胞的增殖、侵襲和遷移, 提示p54nrb/NONO很可能是促進乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移的重要調控蛋白；同時許多的研究表明NONO也能促進黑色素瘤[11]、膀胱移行細胞癌[12]、鼻咽癌[13]的侵襲和轉移。這與適配體LW-25可以特異性識別SC轉移細胞的特性很好的吻合，綜合以上結果推斷NONO極有可能是LW-25的靶標蛋白，并很可能也是引起SC轉移的重要蛋白, 但其作用機制仍不清楚。相信NONO基因功能的深入研究將為臨床預測癌癥轉移和治療癌癥帶來巨大潛力。