背根神經節內GABA重攝取改變在神經痛發生發展中的作用

讓 凌，謝曉芳，冉 然，薛 銳，肖 昀，鄭 飛，唐俊明

神經痛在臨床上很常見，如糖尿病性神經痛、帶狀皰疹后神經痛等，因發生機制尚不清楚，尚缺乏有效的治療手段[1]。神經系統的敏感性升高是神經痛的重要發生機制[2-3]。γ-氨基丁酸(γ-aninobutyrate，GABA)重攝取是釋放入突觸內的GABA作用被終止的主要方式，其通過GABA轉運蛋白(GABA transporter，GAT)將釋放入突觸內的GABA轉運入神經元胞體或膠質細胞內，從而終止GABA的作用，改變神經系統的興奮性[4]。研究[5]已經證實，背根神經節(dorsal root ganglion，DRG)內有GAT3的表達，但神經損傷后GAT3是否發生改變，這些改變是否和神經痛的發生有關，目前還沒有研究涉及。該研究探討了大鼠坐骨神經慢性束縛損傷(chronic constriction injury，CCI)模型上GAT3的改變，并且運用DRG局部注射技術，將GAT3抑制劑注射在DRG局部，探討其對神經痛癥狀的影響，旨在為神經痛的發病機制和治療尋找新的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物成年雄性SD大鼠36只，SPF級，體質量170～220 g，由湖北醫藥學院實驗動物中心提供，動物飼養室溫為(22±2)℃，濕度40%～70%，12 h晝夜交替，自由進食水。所有實驗方案經湖北醫藥學院動物保護和使用委員會批準，按照國際疼痛研究協會的指導原則進行。

1.2 CCI模型參照以往文獻[6-7]，動物水合氯醛(30～40 mg/kg)腹腔注射后在右大腿中部切開皮膚，鈍性分離股二頭肌，暴露坐骨神經干，于坐骨神經分支近端處用4/0#羊腸線在坐骨神經上間隔1 mm做4個松結扎，結扎強度以大腿產生1個小的短暫性抽搐為宜，然后逐層縫合。術后單獨飼養，12 h明暗交替光照，行為學測定確定神經痛造模成功。

1.3 Western blot動物用水合氯醛(30～40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，冰上快速取出L4、L5DRG，置于液氮中保存，經RIPA裂解液(武漢Antgene公司)裂解，離心收集蛋白，用BCA試劑盒測蛋白濃度。每個加樣孔30 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE凝膠電泳后, 轉移到PVDF膜上。用TBS配制的5%脫脂奶粉低速搖床封閉1 h。4 ℃下一抗孵育過夜，TBST洗膜，二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜后加入辣根過氧化酶顯色劑顯色，Bio Rad蛋白成像儀成像, 用Image J軟件測灰度值進行半定量分析。所使用的抗體包括： α-Tubulin(小鼠抗大鼠，抗體稀釋比1 ∶1 000,美國Sigma公司)、GAT3一抗(兔抗大鼠，抗體稀釋比1 ∶750，美國Abcam公司)；GAT3二抗(山羊抗兔，抗體稀釋比1 ∶10 000)、內參二抗(山羊抗小鼠，抗體稀釋比1 ∶10 000，美國Jackson公司)。

1.4 RT-PCR動物用水合氯醛(30～40 mg/kg，ip)麻醉后，冰上快速取出L4、L5DRG，置于液氮中研磨， TRIzol法提取總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，行分光光度計檢測RNA濃度，并逆轉錄為cDNA，按SYBR PremixEx Ⅱ法行實時定量PCR反應，檢測GAT3的表達。引物序列見表1。以GAPDH為內參，使用公式2-ΔΔCt計算mRNA的差異倍數。

表1 引物序列

1.5 L5DRG局部置管參照文獻[8]方法，動物經水合氯醛(30～40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，在大鼠背部L4-L6右側旁開0.5 cm處，切開背部皮膚，鈍性分離皮下組織和椎旁肌肉，暴露L5椎板，在椎間孔內2 mm處鉆1個0.8 mm的孔，將預制的套管插入孔內2 mm，骨水泥固定，連接PE 10聚丙烯管，切口縫合。術后將大鼠分別安置在裝有木屑地板的塑料籠子中，自由攝食和飲水，每次實驗前動物適應環境至少24 h。

1.6 大鼠后爪熱痛閾測定參照文獻[8]方法，用大鼠爪痛覺檢測儀(意大利UGO公司)測定大鼠后爪熱痛閾。將大鼠放在玻璃籠器內，待大鼠適應安靜后，將光源對準大鼠后足掌心，打開光源開關并自動開始計時，直到大鼠因疼痛出現縮足反射，計時結束，此時記錄的時間為后爪熱痛縮退反應潛伏期(paw withdrawal lantency, PWL)。為防止皮膚灼傷，設置最大強度55%，保護時間為25 s。測量5次，每次間隔10 min，取均值，即為大鼠熱痛閾值。

2 結果

2.1 CCI對大鼠痛閾的影響SD大鼠分為假手術組(Sham組，n=6)和CCI組(n=6)，CCI組動物實施坐骨神經結扎，Sham組動物暴露坐骨神經，但不做結扎；與Sham組比較，術后第1天開始，CCI組大鼠PWL出現顯著降低(F=57.296,P<0.05)，這個改變持續到術后7 d。見圖1。

圖1 CCI對大鼠痛閾的影響與Sham組比較：*P<0.05

2.2 CCI對大鼠DRG內GAT3蛋白和mRNA表達的影響與Sham組比較，CCI組DRG 內GAT3蛋白在術后第3天有所增加(t=3.719,P<0.05)，見圖2。與Sham組比較，CCI術后DRG內GAT3 mRNA表達明顯增加(t=5.369,P<0.05)，見圖3。

圖2 CCI術后第3天DRG內GAT3的表達變化與Sham組比較：*P<0.05

圖3 DRG內GAT3 mRNA表達變化與Sham組比較：*P<0.05

2.3 L5DRG局部注射GAT3抑制劑SNAP5114對大鼠痛閾的影響SD大鼠12只，預先置入導管并實施CCI手術，隨機分為CCI組(n=6)和SNAP5114治療組(SNAP組，n=6)，在第3天分別通過導管給CCI組大鼠注射溶劑DMSO(10 μl)，給SNAP組大鼠GAT3抑制劑[(S)-1-[2-[三(4-甲氧基苯基)甲氧基]乙基]-3-哌啶甲酸((S)-1-[2-[tris(4-methoxyphenyl)methoxy] ethyl]-3-piperidinecarboxylic acid，SNAP5114)(200 μg, 10 μl)，分別于注射前、注射后30、60、120 min、24 h、48 h測雙側后爪熱痛閾值PWL，對比雙側后爪PWL。CCI組注射DMSO后大鼠后爪痛閾值沒有明顯改變(P>0.05)。與CCI組(0.369±0.151)比較，SNAP組(0.779±0.095)DRG局部注射SNAP5114 120 min后，患側后爪熱痛閾值明顯上升(F=10.822,P<0.05)，持續至注射后24 h[CCI組：(0.616±0.0501)，SNAP組：(0.859±0.017)；F=42.939，P<0.05]。見圖4。DRG局部注射SNAP5114后120 min，患側后爪熱痛閾值明顯上升，持續至注射后24 h；箭頭表示注射時間。

圖4 L5 DRG局部注射GAT3抑制劑SNAP5114對大鼠痛閾的影響與CCI組比較：*P<0.05

3 討論

本研究采用CCI神經痛模型，CCI 損傷后大鼠表現為自發痛(自發抬起損傷肢體，時而舔足、咬足或甩足，避免損傷側的負重)、痛覺過敏(機械痛敏和熱痛敏)[6-9]。本研究中，與Sham組比較，CCI模型組的大鼠在術后1 d熱痛閾值明顯下降，表現為熱痛敏，并持續到術后7 d，說明造模成功。

因為突觸間隙中GABA不能被酶分解，所以突觸中GABA清除需要GAT的再攝取[10-11]，GAT位于神經元和星形膠質細胞的質膜上，這些轉運蛋白將胞外GABA轉運到細胞內。在中樞神經系統中，與疼痛有關的主要有GAT1和GAT3[10]。先前研究[12]顯示用角叉菜膠注射誘發神經痛后，三叉神經脊束核的三叉神經元GAT3表達增加，并認為這種GAT3表達增加減少了脊髓三叉神經元突觸內GABA的作用時間，導致GABA作用的減弱，從而引起神經系統致敏。但也有研究[5]報道神經痛動物GAT3表達下降，在紫杉醇誘發的神經痛模型中，脊髓背角星形膠質細胞中GAT3的表達是減少的。還有研究[13-15]表明，GAT3在病理狀態下后功能發生改變，出現逆轉運，介導了GABA從神經突觸末梢向突觸內的逆向釋放，這種逆向釋放代償了神經損傷后GABA作用的減弱，因此GAT3表達減少會導致神經痛的發生。總之，神經痛動物中GAT3的改變還存在爭議。而本研究結果顯示，與Sham組比較，術后第3天DRG內GAT3蛋白以及GAT3 mRNA均有所增加，進一步在DRG局部使用GAT3抑制劑后，CCI大鼠的痛閾值明顯升高，出現神經痛的癥狀的緩解。這可能是神經損傷后GAT3的表達增加加速了神經突觸中GABA清除，從而使突觸中GABA濃度降低，作用時間縮短，GABA能抑制信號減弱，導致機體痛覺過敏，是神經痛的發生機制。本研究只探討了GAT3量的改變，GAT3的功能是否在神經損傷后發生改變需要進一步的研究證實。

為特異性的研究L5DRG局部GAT3在神經病理性疼痛發生發展中的作用，術前給予大鼠L5DRG局部置管，排除管子脫落、麻醉等因素影響，在術后第3天通過導管將GAT3抑制劑SNAP5114局部注射在DRG附近，減少了SNAP5114吸收入血或入腦脊液產生副作用。結果表明，注射后24 h大鼠的疼痛有所緩解，提示抑制GAT3對大鼠神經病理痛有一定的鎮痛作用。但連續測定顯示，疼痛緩解的持續時間不長，注射后48 h和對照組痛閾無明顯差異，說明L5DRG內GAT3表達的升高可能并非神經痛發病的主要因素，GAT3升高可能是神經痛其他原發病因導致的結果，需要進一步探討。

綜上所述，神經損傷后DRG內GAT3表達明顯升高，DRG局部給予GAT3抑制劑可短暫緩解神經痛的癥狀，L5DRG內GAT3表達升高并非神經痛發病的主要因素。