miR-141-3p對腦膠質瘤細胞生長和Wnt信號通路的影響

江源銘，盛寶英

miRNA是一種單鏈RNA，其不能編碼蛋白質，miR-141-3p編碼基因位于14號染色體上，屬于miR-200家族，參與腫瘤的發生，其在不同腫瘤組織中的表達水平不同，目前在膠質瘤、胰腺癌、食管癌等腫瘤組織中發現miR-141-3p低表達，而在乳腺癌等腫瘤組織中發現miR-141-3p高表達[1-3]。miR-141-3p參與調控腫瘤細胞的生長，其對于不同的腫瘤細胞作用不同，miR-141-3p可以抑制食管癌等腫瘤細胞的惡性表型[4]。Wnt通路在膠質瘤等腫瘤組織中過度激活，抑制其激活可以逆轉腫瘤細胞惡性增殖，從而發揮抗腫瘤作用[5]。該實驗探討miR-141-3p在腦膠質瘤細胞生長凋亡中的作用及機制，為明確miR-141-3p在腦膠質瘤發生中的作用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料正常星形膠質細胞HA購自上海基免生物科技有限公司；腦膠質瘤細胞CHG-5、U-87MG、U251購自中國醫學科學院腫瘤細胞庫；mimics control、miR-141-3p mimics購自南通百奧邁科生物技術有限公司；Lipotectamine2000購自美國 Invitrogen公司；β-連環蛋白(β-catenin)抗體、c-myc抗體、生存蛋白(survivin)抗體和活化型Caspase-3(C-caspase-3)抗體購自美國Cell Signaling公司。

1.2 Real-time PCR檢測miR-141-3p在膠質瘤細胞中的表達取正常星形膠質細胞HA和腦膠質瘤細胞CHG-5、U-87MG、U251，按照每個25 mm的培養瓶中加入1 ml的TRIzol，置于冰上裂解，期間用移液槍反復吹打，把裂解液轉移到離心管內，添加200 μl的氯仿，在室溫下孵育3 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。RNA存在上層水相溶液中，收集500 μl上層RNA溶液，加入等體積異丙醇，于4 ℃環境中孵育30 min。離心后，將上清液吸除，添加75%的乙醇洗滌沉淀，干燥后，以DEPC水溶解。取提取的RNA樣品，逆轉錄合成cDNA，進行Real-time PCR，程序為：95 ℃、15 min；95 ℃變性15 s；54 ℃、60s；共50個循環。以2-ΔΔCt法分析miR-141-3p水平，內參為U6。實驗重復3次，取均值。

1.3 細胞轉染和過表達效果檢測取U-87MG細胞，接種到24孔細胞培養板中，按照Lipotectamine 2000說明書將mimics control、miR-141-3p mimics轉染至細胞中，轉染24 h后，提取細胞中的總RNA，進行Real-time PCR，步驟同上。設置轉染mimics control、miR-141-3p mimics后的U-87MG細胞為mimics control組、miR-141-3p mimics組，以只加入脂質體轉染試劑Lipotectamine2000的U-87MG細胞為Control組。

1.4 MTT檢測細胞增殖按照細胞量為5×104個/ml將Control組、mimics control組、miR-141-3p mimics組細胞接種到96孔板內，繼續培養24 h以后，將培養板取出，在每個孔內加入0.5%的MTT溶液，孵育4 h以后，吸棄孔內液體，添加DMSO溶液150μl，結晶溶解以后，檢測490 nm的吸光度(A)值，經過空白孔調零以后，分析細胞存活率變化，以Control組細胞存活率為100%，分析mimics control組、miR-141-3p mimics組細胞存活率變化。實驗重復3次，取均值。

1.5 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力將Control組、mimics control組、miR-141-3p mimics組細胞分別接種到6孔板內，每個孔中添加3 000個細胞，同時加入2 ml的細胞培養液，繼續孵育培養14 d以后，吸棄孔內的上清液，PBS洗滌細胞后添加甲醇溶液固定15 min，用蘇木精染色，隨機選取5個視野檢測細胞克隆形成數目。實驗重復3次，取均值。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡將培養24 h后的Control組、mimics control組、miR-141-3p mimics組細胞用PBS洗滌3次以后，每組收集106個細胞，添加500 μl的Binding Buffer混合后，分別加入5 μl的碘化丙啶(propidium iodide，PI)和膜聯蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)溶液，混合后，用流式細胞術測定細胞凋亡變化。實驗重復3次，取均值。

1.7 Western blot檢測β-catenin、c-myc、survivin和C-caspase-3蛋白表達將培養24 h后的Control組、mimics control組、miR-141-3p mimics組細胞用PBS洗滌3次以后，收集細胞，在細胞內加裂解液(按照每個6孔板中添加100 μl裂解液)，在冰上裂解約30 min。收集裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清，分裝后，保存于-80 ℃。吸取2 μl的蛋白樣品以二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法檢測蛋白濃度。蛋白樣品同上樣緩沖液混勻，于100 ℃煮沸10 min后，每個上樣孔加30 μg蛋白樣品進行電泳。制膠：常規方法配制10%分離膠，觀察其凝固以后，添加5%的濃縮膠。蛋白電泳的起始電壓為60 V，觀察溴酚藍進入到分離膠后，將電壓調整到100 V繼續電泳。轉膜：以300 mA電流把凝膠上的蛋白轉印到硝酸纖維素膜(NC膜)上，轉膜置于冰上進行，時間為1.5 h。封閉：用5%牛血清白蛋白于37 ℃搖床封閉約2 h。把NC膜放在含有1 ∶600稀釋的一抗的薄膜抗體孵育袋中，置于4 ℃中過夜。把NC膜放在含有1 ∶3 000稀釋的二抗的抗體孵育袋中，于37 ℃孵育2 h。將NC膜置于ECL試劑中發光，收集圖像，以β-actin為參照，分析β-catenin、c-myc、survivin和C-caspase-3水平。實驗重復3次，取均值。

2 結果

2.1 miR-141-3p在膠質瘤細胞中低表達腦膠質瘤細胞CHG-5(0.68±0.06)、U-87MG(0.27±0.03)、U251(0.49±0.09)中的miR-141-3p表達水平低于正常星形膠質細胞HA(1.00)，差異有統計學意義(F=91.111，P<0.001)。并且U-87MG細胞中miR-141-3p表達水平低于CHG-5和U251細胞。選用U-87MG細胞做后續實驗。

2.2 miR-141-3p mimics提高U-87MG細胞中miR-141-3p表達水平miR-141-3p mimics轉染后的U-87MG細胞中miR-141-3表達水平高于沒有轉染(1.00)及轉染mimics control(0.99±0.09)的細胞，差異有統計學意義(F=26.604，P<0.001)。

2.3 miR-141-3p抑制U-87MG細胞增殖、克隆并促進細胞凋亡miR-141-3p過表達后的U-87MG細胞增殖和克隆形成能力降低，細胞凋亡率升高，與沒有轉染及轉染mimics control的細胞比較，差異有統計學意義。見表1、圖1。

2.4 過表達miR-141-3p對U-87MG細胞中β-catenin、c-myc、survivin和C-caspase-3蛋白表達水平影響miR-141-3p過表達后的U-87MG細胞中β-catenin、c-myc、survivin蛋白表達水平降低，C-caspase-3 蛋白表達水平升高，與沒有轉染及轉染mimics control組的細胞比較，差異有統計學意義。見圖2、表2。

表1 各組U-87MG細胞存活率、克隆形成數目和凋亡率比較

與mimics control組比較：*P<0.05

圖1 流式細胞術測定miR-141-3p對U-87MG細胞凋亡影響表2 各組U-87MG細胞中β-catenin、c-myc、survivin和C-caspase-3蛋白表達水平比較

項目Control組mimics control組miR-141-3p mimics組F值P值β-catenin0.89±0.060.90±0.070.45±0.05?54.027<0.001survivin0.63±0.060.60±0.080.58±0.07?20.4520.002c-myc0.60±0.050.58±0.070.42±0.03?10.5540.011C-caspase-30.43±0.040.40±0.060.68±0.04?31.2790.001

與mimics control組比較：*P<0.05

圖2 Western blot分析各組細胞中β-catenin、c-myc、 survivin和C-caspase-3蛋白表達影響1：Control組；2：mimics control組；3：miR-141-3p mimics組

3 討論

miRNA長度約為15～25 bp，其在人體組織中廣泛表達，胚胎發育、組織功能維持等生理過程中幾乎均有miRNA的參與，miRNA還參與調控心血管系統疾病、腫瘤等病理過程[6]。miR-141-3p是一種與細胞生長凋亡等密切相關的調控因子，參與調控神經細胞等多種細胞的正常生理功能發揮[7]。miR-141-3p在腫瘤組織中異常表達，其可以作為腫瘤促進因子或腫瘤抑制因子發揮腫瘤細胞生長調控作用，目前在乳腺癌等腫瘤組織中發現miR-141-3p過表達，也有研究顯示miR-141-3p在乳腺癌及食管癌組織中低表達，miR-141-3p可能是一種腫瘤抑制因子[8-12]。本實驗結果顯示，miR-141-3p在膠質瘤細胞中的表達水平低于正常星形膠質細胞，提示miR-141-3p在膠質瘤中可能發揮抗腫瘤作用。

miRNA參與腫瘤發生過程往往與腫瘤細胞的多種生物學特性有關，目前的研究表明，miR-141-3p對于腫瘤細胞的生長、凋亡等具有重要作用，miR-141-3p能夠抑制胃癌等腫瘤細胞的生長，而miR-141-3p對于前列腺癌等腫瘤細胞的生長具有促進作用[13]。本次實驗研究顯示，miR-141-3p過表達后的膠質瘤細胞的增殖和克隆形成能力降低，細胞凋亡增多，細胞中凋亡標志蛋白Caspase-3活化水平升高，miR-141-3p在膠質瘤生長中發揮抑制作用。

Wnt信號通路能夠把細胞表面的信號傳遞至細胞內，其是由β-catenin、c-myc、survivin等組成，其中β-catenin是Wnt信號通路激活的關鍵，β-catenin也是Wnt信號通路的中心，β-catenin表達水平的高低可以間接反映Wnt信號通路的激活水平；survivin是一個凋亡抑制基因，其具有抑制細胞凋亡的作用，Wnt信號通路激活可以促進survivin表達；c-myc是Wnt信號通路的下游靶基因，也是一種癌基因[14]。很多研究[15]顯示，Wnt信號通路在腫瘤中過度激活，抑制其激活可以抑制腫瘤發生和進展。本研究顯示，miR-141-3p過表達可以下調膠質瘤細胞中β-catenin、c-myc、survivin的表達水平，miR-141-3p能夠負調控Wnt信號，miR-141-3p抑制膠質瘤生長機制可能與Wnt信號通路有關。