玉溪、許昌烤煙煙葉中淀粉酶基因的表達及酶活性分析

翟 妞，徐國云，鄭慶霞，何聲寶，張 慧，劉萍萍，許亞龍，陳千思，王 晨，周會娜*

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2 號 450001

2.國家煙草質量監督檢驗中心，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2 號 450001

淀粉是煙葉在生育期積累的主要碳水化合物，在鮮煙葉中的含量高達30%～40%［1］。淀粉含量是煙葉質量評價的常規指標之一，其水解產物含量的高低可直接影響煙葉的感官特性，同時還可通過美拉德反應產生一系列煙葉香味成分［2］?？緹煙熑~在生育期需積累一定的淀粉，但烤后煙葉中殘留的淀粉則會影響煙葉的外觀和品質［3］，因此要盡可能將其水解。在調制過程中，煙葉的大部分淀粉能被淀粉酶水解成糖類［4-5］，通過添加外源淀粉酶可使淀粉充分水解［2-3,6］。煙草中的淀粉酶主要為α-淀粉酶和β-淀粉酶，普遍存在于葉肉細胞中，能斷裂淀粉中的糖苷鍵［7］。

研究發現在云南、河南兩地，成熟期煙葉中的淀粉含量差異不大，但調制后云南煙葉中的糖含量明顯高于河南［8-9］。還發現在烘烤過程中，淀粉、可溶性糖與淀粉酶的活性高度相關［10］。本實驗室人員前期研究發現，不同年份鮮煙葉中的淀粉含量存在較大波動，云南鮮煙葉中的淀粉含量并不總是高于河南，但兩者烤后煙葉之間的糖含量差異則較為穩定，表明高含糖量的云南煙葉可能與淀粉積累多、降解少有關（數據未發表）。鑒于此，以河南許昌和云南玉溪成熟期烤煙中部鮮煙葉為研究對象，通過分析表達譜芯片中與淀粉降解相關的差異表達基因并進行實時熒光定量PCR（qPCR）驗證，進一步檢測淀粉酶活性、淀粉和總糖含量，旨在了解云南、河南兩地煙葉中糖含量差異的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料

K326 采集于云南玉溪江川，中煙100 采集于河南許昌襄縣。采集年份為2013 和2018 年。上午10 點采集成熟期第10 葉位葉片（從上往下），立即冷凍于液氮中，-80 ℃保存。

1.1.2 試劑

植物RNA 提取試劑盒（貨號：RN38）購自北京艾德萊生物技術有限公司；反轉錄試劑盒（貨號：RR047A）購自寶生物工程（大連）有限責任公司；熒光定量PCR 試劑盒FastStart Universal SYBR Green Master（貨號：4913914001）購自美國Roche公司；蛋白定量試劑盒PierceTMBCA Protein Assay Kit（貨號：23225）購自美國Thermo 公司；α-淀粉酶活性檢測試劑盒（貨號：A081647-S）和β-淀粉酶活性檢測試劑盒（貨號：A09215-S）購自上海晶抗生物科技有限公司。其他常規試劑均為上海國藥集團化學試劑有限公司分析純試劑。引物由生工生物（上海）工程有限責任公司合成。

1.1.3 儀器

PL-602L 電 子 天 平（瑞 士Mettler Toledo 公司）；電子天平MS105（瑞士Mettler Toledo 公司）；冷凍臺式離心機5424R（德國Eppendorf 公司）；超聲波破碎儀VCX130（美國Sonnics 公司）；超微量分光光度計Nanodrop 2000（美國Thermo 公司）；實時熒光定量PCR 儀LightCycler?96（美國Roche 公司）；酶標儀SpectraMax plus 384（美國MD 公司）；烘箱FD115（德國Binder 公司）；連續流動分析儀AA3（英國Seal 公司）。

1.2 方法

1.2.1 煙葉cDNA 制備

將煙葉在液氮中充分研磨后，按照植物RNA提取試劑盒說明書進行RNA 提取。利用超微量分光光度計檢測RNA 質量，RNA 濃度≥50 μg/mL、OD260/OD280在1.8～2.0 之 間。將RNA 反 轉 錄 成cDNA，用于qPCR 分析。反轉錄體系和反應條件參考張慧等［11］方法。

1.2.2 實時熒光定量PCR（qPCR）

qPCR 擴增體系：10 μL 2×SYBR Green Master，10 μmol/L 正反向引物各0.5 μL，2 μL 稀釋10 倍的反轉錄產物，ddH2O 補至20 μL。

qPCR 反應 條 件：95 ℃10 min；95 ℃10 s，58 ℃15 s，72 ℃15 s，40 個 循 環；95 ℃5 s，65 ℃1 min，以0.1 ℃/s 升溫至97 ℃。β-actin 為內參基因，每個基因各重復3 次。根據CT值計算基因的變化倍數，具體參考張慧等［11］方法。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.3 煙葉總蛋白的提取及定量

將保存于-80 ℃的煙葉樣品在液氮中充分研磨，置于1.5 mL EP管液氮預冷后，取0.1 g加入1 mL提取緩沖液NE。渦旋振蕩混勻后，冰上靜置1 h。5 000 r/min 離心20 min 后，取上清液，即為蛋白提取液。

取10-1倍的蛋白提取液，按照BCA 蛋白濃度測定試劑盒說明書測定蛋白濃度。根據標準曲線、樣品吸光值得到蛋白含量。

蛋白濃度（μg/μL）=［蛋白含量/稀釋液總體積］×稀釋倍數。

蛋白 提 取NE 緩 沖 液：20 mmol/L Hepes（pH 7.5），40 mmol/L KCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF。

1.2.4 淀粉酶活性的檢測

同一試驗田采集6 份煙葉樣品，每份樣品重復3 次。將每份樣品的蛋白提取液按照α-和β-淀粉酶活性檢測試劑盒說明書進行檢測，并對結果進行T 檢驗。

α-或β-淀粉酶活性（U/μg 全蛋白）=樣品的活性濃度×上樣體積/上樣蛋白總量。

1.2.5 煙葉總糖、淀粉含量的檢測

同一試驗田采集6 份煙葉混合樣品，作為6 次重復。采用YC/T 159—2002［12］方法測定煙葉總糖含量（質量分數）；采用YC/T 216—2013［13］方法測定煙葉淀粉含量（質量分數）。對結果進行T檢驗。

1.2.6 基因芯片分析

芯片制備由國家煙草基因研究中心和美國Affymetrix 公司完成，具體芯片信息參照“煙草SNP 芯片研制及標準、典型表達圖譜繪制”的技術報告（數據未公開）。芯片檢測和數據分析由北京博奧生物有限公司和國家煙草基因研究中心完成。

使用R 語言affy 芯片數據分析包中的rma 函數對芯片進行標準化，然后對典型香型煙草中玉溪和許昌樣品進行分組并使用T 檢驗進行差異顯著性分析，利用R 語言中p.adjust 函數對T 檢驗結果中的P 值進行Bonferroni 矯正，選取玉溪、許昌兩地煙葉中表達差異倍數大于2 的基因，矯正后P＜0.05 為差異基因。

2 結果與分析

2.1 玉溪、許昌煙葉中淀粉和總糖含量分析

分析2013 年許昌、玉溪成熟期烤前煙葉中淀粉和總糖含量（圖1），發現玉溪、許昌煙葉中淀粉含量分別為33.00%、35.00%，二者沒有顯著差異。而總糖含量，玉溪煙葉（2.10%）明顯低于許昌煙葉（3.20%）。在全國煙葉質量與品種試驗數據庫（http://10.6.0.81/）中，2013 年玉溪、許昌烤后煙葉淀粉含量分別為5.65%、4.16%，總糖含量分別為36.46%、20.6%，烤后煙葉中總糖含量玉溪明顯高于許昌。推測在煙葉成熟到烘烤過程中，淀粉降解是否充分對烤后煙葉中的總糖含量起到關鍵作用。

圖1 玉溪和許昌煙葉中的淀粉和總糖含量Fig.1 Contents of starch and total sugar in tobacco leaves from Yuxi and Xuchang

2.2 2013 年玉溪、許昌煙葉中淀粉降解相關基因的篩選及表達量驗證

在玉溪和許昌成熟期中部煙葉2013 年的表達譜芯片中，涉及淀粉降解的基因有12 個，分別為Ntab0658590、 Ntab0621070、 Ntab0910040、Ntab0174330、 Ntab0838220、 Ntab0077560、Ntab0169680、 Ntab0811610、 Ntab0938990、Ntab0084570、Ntab0282340 和Ntab0282870。在 玉溪和許昌兩地，有4 個表達量有顯著差異的淀粉酶基因，分別是2 個α-淀粉酶基因（Ntab0174330 和Ntab0838220）和2 個β-淀粉酶基因（Ntab0811610和Ntab0938990），這4 個基因在玉溪煙葉中表達量較高。qPCR 結果（圖2）表明，4 個基因中Ntab0938990 的表達量最高，Ntab0174330 的表達量最低。表達量高低依次為Ntab0938990＞Ntab0838220＞Ntab0811610＞Ntab0174330。

圖2 玉溪和許昌煙葉中4 個淀粉酶基因的表達Fig.2 Expressions of four amylase genes in tobacco leaves from Yuxi and Xuchang

2.3 2013 年玉溪與許昌煙葉中淀粉酶活性的差異

煙草葉片主要通過α-淀粉酶和β-淀粉酶將淀粉降解成糖類。在已報道的文獻中［1,4-7］主要關注于α-和β-淀粉酶，鮮有淀粉酶基因的相關報道?；蛐酒皅PCR 結果（2.2 節）表明，在玉溪和許昌煙葉中有4 個差異表達的淀粉酶基因。為此，進一步檢測玉溪和許昌煙葉中α-和β-淀粉酶的活性。在2013 年，許昌和玉溪成熟期中部煙葉中α-和β-淀粉酶活性結果（圖3）表明，兩地煙葉中α-和β-淀粉酶的活性變化趨勢一致，即均在玉溪煙葉中較高，分別是許昌煙葉的2.6 和2.2 倍。

2.4 玉溪、許昌煙葉中淀粉酶基因表達和活性的年份差異

圖3 玉溪和許昌煙葉中α-和β-淀粉酶的活性（2013 年）Fig.3 Activities of α-and β-amylases in tobacco leaves from Yuxi and Xuchang(2013)

為分析不同年份間玉溪和許昌煙葉中淀粉酶基因的表達及其酶活性的差異，于2018 年重新對兩地煙葉進行α-和β-淀粉酶基因的表達及其酶活性的分析。與2013 年相比，在2018 年玉溪煙葉中，α-淀粉酶基因（Ntab0174330、Ntab0838220）和β-淀粉酶基因（Ntab0811610、Ntab0938990）的表達量明顯高于許昌煙葉（圖4）。同時檢測了兩地煙葉樣品中α-和β-淀粉酶活性，發現玉溪煙葉中的α-淀粉酶活性（5.10×10-5U/μg 全蛋白）和β-淀粉酶活性（1.50×10-4U/μg 全蛋白）都高于許昌煙葉（4.70×10-5U/μg 全蛋白，1.30×10-4U/μg 全蛋白）（圖5）。在全國煙葉質量與品種試驗數據庫（http://10.6.0.81/）中，2018 年玉溪、許昌烤后煙葉淀粉含量分別為4.10%、4.49%，總糖含量分別為32.18%、24.97%，烤后煙葉中總糖含量玉溪明顯高于許昌。綜上，兩個年份之間，玉溪和許昌煙葉中淀粉酶基因的表達和酶活性以及烤后煙葉中總糖的變化趨勢一致。

圖4 玉溪和許昌煙葉中α-和β-淀粉酶基因的表達（2018 年）Fig.4 Expressions of α-and β-amylase genes in tobacco leaves from Yuxi and Xuchang(2018)

圖5 玉溪和許昌煙葉中α-和β-淀粉酶的活性（2018 年）Fig.5 Activities of α-and β-amylases in tobacco leaves from Yuxi and Xuchang(2018)

3 討論

淀粉含量是煙葉質量評價的常規指標之一，淀粉降解產物中糖含量的高低直接影響煙葉的感官品質。從鮮煙葉看，玉溪煙葉中的淀粉含量和許昌沒有顯著差異，總糖含量玉溪低于許昌；而在烤后煙葉中，玉溪煙葉中的總糖含量明顯高于許昌煙葉。對比兩地煙葉烤前、烤后的總糖含量，推測玉溪、許昌兩地煙葉的淀粉降解存在差異，玉溪煙葉在烘烤過程中淀粉降解較為充分，而許昌煙葉的淀粉降解不太充分。而淀粉酶在淀粉降解過程中起關鍵作用，玉溪和許昌煙葉在烘烤過程中淀粉降解的差異，可能與兩地煙葉中淀粉酶的活性有關。本研究結果證實了這一推論，明確了4個在玉溪和許昌煙葉中表達量具有顯著差異的淀粉酶基因，即α-淀粉酶基因Ntab0174330、Ntab0838220 和β-淀 粉 酶 基 因Ntab0811610、Ntab0938990。同時檢測玉溪和許昌煙葉中的α-和β-淀粉酶活性，結果表明玉溪煙葉中α-和β-淀粉酶活性都高于許昌煙葉。

近年來，煙葉中淀粉酶基因及淀粉酶活性被逐漸關注［14］。通過分析云南玉溪和河南許昌煙葉中淀粉酶活性的差異和淀粉酶基因表達的差異，結合兩地煙葉烤前、烤后的淀粉和總糖含量差異，發現淀粉酶在烤后煙葉總糖含量中起著關鍵作用，而不是烤前煙葉的淀粉積累量。已有研究結果表明，在煙葉烘烤過程中通過添加外源淀粉酶可促使淀粉充分降解［2-3,6］。宮長榮等［15］研究表明，河南煙葉在烘烤過程中β-淀粉酶的活性最高。在后續研究中，可根據本研究結果，以α-淀粉酶基因Ntab0174330、Ntab0838220 和β-淀粉酶基因Ntab0811610、Ntab0938990 為目標基因，尤其是β-淀粉酶基因Ntab0938990（在兩地中表達量都最高），在煙草中構建超量表達的轉基因植株，為分子輔助育種提供材料。

4 結論

①玉溪、許昌兩地鮮煙葉中的淀粉含量差異不顯著。②4 個淀粉酶基因在玉溪煙葉中的表達量較高，即α-淀粉酶基因Ntab0174330、Ntab0838220和β-淀粉酶基因Ntab0811610、Ntab0938990。③玉溪鮮煙葉中的α-和β-淀粉酶活性高于許昌煙葉。兩個年份數據表明，玉溪、許昌兩地煙葉中的α-和β-淀粉酶活性變化趨勢一致。