雞矢藤顆粒劑干預(yù)大鼠肝纖維化模型TGF-β1/Smad通路試驗(yàn)

袁 勇 呂傳柱 -

(1. 海南醫(yī)學(xué)院，海南 海口 570102；2. 海南醫(yī)學(xué)院急救與創(chuàng)傷研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 570102；3. 海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院海南省急危重癥臨床醫(yī)學(xué)研究中心，海南 海口 570102)

肝纖維化是一種慢性漸進(jìn)性病理過(guò)程，多發(fā)于肝硬化、肝癌等多種肝病中。導(dǎo)致肝纖維化的原因有很多，如酒精性肝損傷、活動(dòng)性病毒性肝炎、脂肪肝、藥物性肝損傷等，最終導(dǎo)致彌漫性膠原或非膠原物質(zhì)在肝內(nèi)大量沉積，其核心病理改變是肝內(nèi)發(fā)現(xiàn)肝星狀細(xì)胞(Hepaticstellate cells，HSCs)激活并大量增殖，成肌纖維細(xì)胞樣細(xì)胞是病理改變的最后呈現(xiàn)形式[1-2]。在HSCs激活并增殖的過(guò)程中，各種致纖維化介質(zhì)如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transfo-rminggrowth fatorbata，TGF-β1)會(huì)大量分泌，大量研究[3-6]表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1是造成肝纖維化進(jìn)展的最主要細(xì)胞因子，能使肝星狀細(xì)胞激活和大量分泌膠原或非膠原物質(zhì)，與肝纖維化的進(jìn)展有強(qiáng)關(guān)聯(lián)性。而IL-1β、IL-6、TNF-α是肝臟炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵炎癥因子，常用于評(píng)價(jià)肝纖維化中因炎癥造成肝損傷程度[7]。

中醫(yī)認(rèn)為肝纖維化程度和肝臟產(chǎn)生大量瘀血密切相關(guān)，抗肝纖維化治療過(guò)程中可以選用活血化瘀類中藥[8]。雞矢藤是著名南藥之一，廣泛生長(zhǎng)于瓊海，具有活血止痛的功效[9-11]。已有研究[12]發(fā)現(xiàn)，雞矢藤可以抑制TGF-β1mRNA的表達(dá)，減緩肝纖維化的進(jìn)程，但其表達(dá)的具體傳導(dǎo)通路還有待進(jìn)一步探究。試驗(yàn)擬對(duì)雞矢藤干預(yù)大鼠肝纖維化模型的TGF-β1/Smad通路進(jìn)行探究，以期為篩選有效抗肝纖維化中藥研究提供借鑒案例。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與藥物

雞矢藤顆粒劑：廣州一方藥業(yè)公司；

Trizol試劑：純度99%，美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司；

白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒：武漢華美生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物序列 引物TGF-β1序列和內(nèi)參照引物序列參照參考文獻(xiàn)[12]。引物Smad3序列：Forward 5’CCAGGCCTCTTGATGGTCGT3’；Reverse 5’GGCGGAAGTTCTGTTAGAAT3’。引物Smad7序列：Forward 5’CTTTCGCTTGGGTCAACTCTC3’；Reverse 5’TGGGATCACGCATATATTTCC3’。

1.2.2 動(dòng)物分組、造模及給藥 參照文獻(xiàn)[12]。

1.2.3 Smad3和Smad7 mRNA表達(dá)檢測(cè) 熒光實(shí)時(shí)定量法[12]。

1.2.4 TGF-β1檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[12]。

1.2.5 血清指標(biāo)(IL-1β、IL-6、TNF-α)檢測(cè) ELISA法[13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果及分析

2.1 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α的水平

如表1所示，C組與A組差異極顯著(P<0.01)，與B組差異顯著(P<0.05)。說(shuō)明雞矢藤對(duì)肝纖維化有理想療效。

表1各組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α的水平?

Table 1 Comparison of IL-1β,IL-6 and TNF-alevels in rats in each group(n=10)

ng/mL

? *表示A組的各項(xiàng)指標(biāo)與B組和C組有極顯著差異(P<0.01)；△表示B組的各項(xiàng)指標(biāo)與C組有顯著差異(P<0.05)。

2.2 各組TGF-β1、Smad3和Smad7的mRNA的表達(dá)水平

如表2所示，對(duì)于TGF-β1mRNA的表達(dá)，C組與A組差異顯著(t=2.245，P<0.05)，與B組差異極顯著(t=1.142，P<0.01)；對(duì)于Smad3 mRNA的表達(dá)，C組與A組差異顯著(t=2.149，P<0.05)，與B組差異極顯著(t=1.206，P<0.01)；對(duì)于Smad7 mRNA的表達(dá)，C組與A組差異顯著(t=2.201，P<0.05)，與B組差異極顯著(t=1.007，P<0.01)。說(shuō)明雞矢藤可以明顯抑制TGF-β1mRNA和Smad3 mRNA的表達(dá)，促進(jìn)Smad7 mRNA的表達(dá)。

表2各組TGF-β1、Smad3和Smad7的mRNA的表達(dá)水平?

Table 2 Comparison of mRNA expression values of TGF-β1,Smad3 and Smad7 in each group(n=10)

組別TGF-β1/GAPDHSmad3/GAPDHSmad7/GAPDHA0.896 2±0.112 4*0.905 4±0.105 6**2.927 6±0.190 7***B2.875 6±0.204 42.875 6±0.204 43.458 4±0.114 5C1.156 8±0.105 4△1.025 0±0.004 6△△4.689 1±0.203 7△△△

? *表示B組的TGF-β1指標(biāo)與C組比有顯著差異(t=1.142，P<0.01)，**表示B組的Smad3指標(biāo)與C組比有顯著差異(t=1.206，P<0.01)，***表示B組的TGF-β1指標(biāo)與C組比有顯著差異(t=1.007，P<0.01)；△表示C組的TGF-β1指標(biāo)與A組比有差異(t=2.245，P<0.05)，△△表示C組的Smad3指標(biāo)與A組比有差異(t=2.149，P<0.05)，△△△表示B組的Smad3指標(biāo)與A組比有差異(t=2.201，P<0.05)。

3 結(jié)論

雞矢藤可以疏肝和胃，具有一定的活血止痛功效，在臨床中可以起到降酶保肝護(hù)肝之效。Smad3 mRNA-(TGF-β1mRNA)-Smad7 mRNA的軸性作用通道在抗肝纖維化的作用機(jī)制中發(fā)揮著作用。當(dāng)肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)(膠原或非膠原)過(guò)度沉積，HSCs激活并增殖的過(guò)程中，各種致纖維化介質(zhì)如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1會(huì)大量分泌，由此會(huì)促進(jìn)肝纖維化進(jìn)一步進(jìn)展，具體表現(xiàn)在Smad3 mRNA的表達(dá)會(huì)隨之增加。采用雞矢藤抗肝纖維化的干預(yù)治療后，各種致纖維化介質(zhì)如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1會(huì)分泌減少，由此會(huì)阻斷肝纖維化進(jìn)一步進(jìn)展，具體表現(xiàn)在Smad7 mRNA的表達(dá)會(huì)隨之增加。至于是否存在反饋機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。