玉米種子純度SSR分子標記檢測研究報告

李世聰 朱華國 薛飛

摘 ? 要：本試驗利用SSR分子標記法，對玉米雜交種金慶707和世賓338玉米雜交種的種子純度進行了檢測。結果表明：8對SSR引物bnlg1940k7、 phi053k2、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg1702k1、phi080k15和umc1492y13可用于金慶707種子純度鑒定;8對SSR引物umc2105k3、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg161k8、bnlg1702k1、umc1545y2、phi080k15和umc1432y6可用于品種世賓338種子純度鑒定。選用引物phi053k2檢測金慶707的種子純度為92%，選用引物bnlg1702k1檢測世賓338的種子純度為66%，兩者均未達到國家標準。本研究從玉米20對SSR核心引物中篩選出8對多態性引物可用于金慶707和世賓338兩個品種的種子純度檢測，大大縮短了種子純度檢測的周期。

關鍵詞：SSR分子標記;玉米雜交種;種子純度

玉米是我國一種很重要的糧食作物，也是飼料加工的重要來源，在我國農業生產中處于很重要的位置[1]。種子是農業生產中最根本的生產資料，種子質量的好壞決定了農作物產量的多少和品質的優良，而種子純度的高低又是顯示種子質量好壞的一項重要因素[2]。種子純度的檢測是發揮作物產量潛能和保證作物質量的必要措施。根據前人的研究，種子純度下降1個百分點，將會直接導致作物產量減少大約1%[3]。種子市場的不規范，對育種者、種植戶以及經銷商的利益造成極大的損害。新疆是中國的農業大省，種子市場的“多亂混雜”，嚴重危害到育種者、種植戶以及經銷商的利益，所以種子純度的鑒定十分必要。種子純度鑒定的方法主要包括田間形態鑒定和生化標記鑒定及DNA分子標記鑒定等[4]。

最初的田間形態鑒定，存在鑒定周期長、結果受環境影響較大、準確性差等缺點[5];生化標記鑒定是利用不同品種蛋白質的不同得以鑒定，蛋白質電泳鑒定容易遭受環境和生長狀況的影響。陳皆輝[6]、張承毅[7]等人利用生化標記鑒定的方法快速準確地將不同品種分開。相比之下，SSR標記具有多態性高、呈共顯性、操作簡便等優點[8]。SSR分子標記法已廣泛應用于各種農作物的真實性以及純度鑒定，李苗[9]、

劉宏魁[10]、李陽[11]等人利用多態性SSR引物對玉米種子純度和指紋圖譜進行了分析。吳明生[12]等人利用SSR標記檢測了辣椒的種子純度。對玉米種子純度進行檢測，利于玉米種子市場的監管、保障生產者和經營者的利益。

本研究從玉米20對SSR引物中篩選出可用于金慶707和世賓338兩個玉米品種純度鑒定的特異性引物，并利用特異性引物對金慶707和世賓338抽樣種子進行純度鑒定。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 材料

試驗材料：金慶707雜交種及其父母本種子、世賓338及其父母本種子，20對SSR引物序列來自數據庫（https：//www.maizegdb.org/）。

試劑：氯仿、SDS提取液、異丙醇、5mol/L氯化鈉溶液、β-巰基乙醇、70%乙醇、TE緩沖液、ddH2O、10×Buffer、MgCl2、dNTP、Taq酶、引物、95%乙醇。

1.2 ? 試驗方法

1.2.1 ? SDS法提取玉米種子的DNA

參考郭景倫等[13]的方法，提取玉米DNA，每個品種隨機選取50粒種子提取種子胚中的DNA。

1.2.2 ? SSR引物篩選及純度鑒定

選取玉米品種鑒定技術規程NY/T 2475-2013中公布的20對玉米SSR引物，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。以金慶707和世賓338父母本基因組DNA為模板，經過PCR擴增和8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，在20對SSR引物中篩選出能夠明顯區分父母本的多態性引物。

PCR反應體系：10×PCR Buffer 2μL，2.5mM dNTPs1.2μL，上下游引物10μM各0.25μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.2μL，模板DNA2μL，無菌水補全到20μL。SSR的擴增程序為：94℃預變性4min，94℃變性45s，引物退火溫度退火45s，72℃延伸45s，共35個循環;72℃延伸10min，PCR產物保存于4℃。反應程序的反應時間、溫度、次數等可根據PCR儀器、酶以及引物等的不同作出相應的調節。

擴增產物通過8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（150V60～80min）分離，銀染顯色，觀察記錄。

1.2.3 ? 數據記錄

檢測樣品與對照樣品（父本、母本）在同一電泳板上并排電泳時，將檢測樣品與對照樣品兩兩比較，并標記每個位點的異同情況。

2 ? 結果與分析

2.1 ? 用于金慶707和世賓338純度鑒定的多態性SSR引物篩選

20對SSR引物對金慶707和世賓338父母本DNA進行擴增，結果分別見圖1、圖2。在金慶707親本間擴增產物具有明顯差異的引物有bnlg1940k7、phi053k2、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg1702k1、phi080k15、umc1492y13共8對SSR引物，在世賓338親本間擴增產物具有明顯差異的引物有umc2105k3、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg161k8、bnlg1702k1、umc1545y2、phi080k15、umc1432y6共8對SSR引物。

2.2 ? 金慶707種子純度鑒定

從篩選出的8對可用于金慶707種子純度鑒定的引物中選用引物phi053k2對金慶707及其父母本基因進行擴增，通過對電泳條帶的分析可以得出金慶707種子樣本的純度。結果如圖3所示，所抽種子檢測樣品樣本有3種類型：雜交種金慶707種子、父本自交系種子和母本自交系種子。根據公式計算，本批金慶707種子純度為92%，其中有4%的父本自交系雜種，4%的母本自交系雜種。

2.3 ? 世賓338種子純度鑒定

選用引物bnlg1702k1對世賓338及其父母本DNA進行擴增，對抽樣批次世賓338種子樣本的種子純度進行檢測，結果如圖4所示，所抽種子檢測樣品樣本有2種類型：雜交種種子和母本自交系種子。經過計算，本批世賓338的種子純度為66%，含有34%的母本自交系雜種。

3 ? 討論

本研究從20對玉米SSR引物中篩選出多態性引物，對金慶707和世賓3382個品種的種子純度進行了檢驗。劉勤紅[14]、盧虹[15]、李汝玉等[16]采用了SSR分子標記的方法，分別在棉花、油菜和玉米等作物的種子純度上進行研究，并且得到的結果與傳統田間鑒定相符合。結合前人大量試驗和本試驗的結果表明，SSR分子標記法在玉米和其他作物的種子純度鑒定中都能夠取得良好的結果。

4 ? 結論

本試驗利用SSR分子標記法對2個玉米雜交種金慶707和世賓338進行了種子純度鑒定。金慶707玉米雜交種抽樣批次的種子純度為92%， 世賓338玉米雜交種抽樣批次的種子純度為66%，都未達到玉米單交種大田用種96.0%的種子質量標準要求。

參考文獻：

[ 1 ] 羅黎明，劉麗，于麗娟，等.DNA分子標記技術在玉米種子純度鑒定中的應用[J].生物技術進展，2011，1（1）：7-13.

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[ 11 ] 李陽，范夢偉，季曉坤，等.利用SSR技術鑒定玉米雜交種“家佳榮2號”的種子純度[J].西南農業學報，2018，31（7）：1349-1354.

[ 12 ] 吳明生，趙海艷，黃鈴冰.利用SSR標記快速鑒定辣椒種子純度[J].種子世界，2017（11）：13-15.

[ 13 ] 郭景倫，趙久然，尉德銘，等.玉米單粒種子DNA提取新方法[J].北京農業科學，1997（2）：2-3.

[ 14 ] 劉勤紅，王芙蓉，張軍，等.利用SSR標記鑒定魯棉研15號雜交種純度的研究[J].山東農業科學，2003（2）：7-9.

[ 15 ] 盧虹，徐愛遐.SSR分子標記技術在甘藍型油菜雜交種陜油16純度鑒定中的應用[J].種子，2016，35（6）：123-126.

[ 16 ] 李汝玉，李群，譚振馨，等.利用SSR標記鑒定玉米雜交種純度技術規程[J].種子，2005（9）：54-56.

（收稿日期：2019-03-31）