褪黑素對大鼠糖尿病視網膜病變的影響

刁慧杰，劉 芳，李金穎，崔 紅

0引言

目前，我國糖尿病確診人數超過9 000萬，隱性患者近1.5億人。隨著我國人民壽命的提高和生活水平不斷改善，糖尿病的發生呈快速上升趨勢。糖尿病視網膜病變是糖尿病最嚴重的并發癥之一，糖尿病病史10a患者中糖尿病視網膜病變的發病率為50%，糖尿病病史超過20a的患者中，糖尿病視網膜病變的患病率幾乎為100%。糖尿病患者體內長期高血糖狀態引起蛋白激酶C、糖基化血紅蛋白及多元醇代謝產物增加，影響了視網膜的生理功能并啟動了氧化應激損傷[1-2]。無論是糖尿病大鼠模型還是高糖培養的視網膜色素上皮細胞，均顯示視網膜脂質過氧化物水平顯著升高，抗氧化酶水平減低。褪黑素(melatonin, MLT)因其對糖尿病患者的葡萄糖和脂質代謝的調節代謝作用而被廣泛認可。我們將褪黑素引入到糖尿病視網膜病變的治療中，也是基于其有效降低脂質過氧化物水平、減輕氧化應激損傷的功效[3]。褪黑素對糖尿病患者及糖尿病動物模型的調節糖脂代謝及抗氧化的作用已受到廣泛重視，但是，關于褪黑素對糖尿病視網膜組織影響的相關報道較少。本研究建立了糖尿病大鼠模型，觀察褪黑素對糖尿病大鼠視網膜的保護作用并探討了其作用機制。

1材料和方法

1.1材料褪黑素(Sigma-Aldrich公司，用無水乙醇溶解)；DMEM培養液(Hyclone公司)；4%多聚甲醛及2.5%戊二醛(北京索萊寶科技有限公司)；1%鋨酸(上海哈靈生物科技有限公司)；枸櫞酸鉛和2%醋酸雙氧鈾(上海容創生物技術有限公司)；手術顯微鏡(德國Leica公司，型號：M525 F40)；切片機(德國Leica公司，型號：EM UC7)；倒置生物顯微鏡(上海光學儀器廠，型號：37XF)；電泳儀(北京六一生物科技有限公司，型號：DYCZ-40D)；蘇木素-伊紅染色劑(武漢博士德生物工程有限公司)；BCA蛋白測定試劑盒、裂解液、PVDF膜及化學發光試劑、B細胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma/lewkmia-2, Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X Protein, Bax)及P53抗體(上海碧云天公司)。

1.2方法

1.2.1糖尿病大鼠模型制備及干預清潔級雄性SD大鼠[牡丹江醫學院醫藥研究中心實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SYXK(黑)2015-007]40只，體質量160±20g，清潔級環境飼養，喂養期間提供標準動物飼料，自由飲水進食，符合衛生部頒布的《衛生部醫學實驗動物管理實施細則》和《實驗動物管理條例》的規定。隨機分為正常對照組、糖尿病組、低劑量褪黑素組和高劑量褪黑素組，每組10只，所有大鼠進行適應性喂養1wk。糖尿病組、低劑量褪黑素組和高劑量褪黑素組大鼠禁食12h后按照腹腔內注射60mg/kg鏈脲佐菌素建立糖尿病模型，正常對照組注射等量的生理鹽水。72h后自動血糖分析儀檢測尾靜脈血糖，濃度>16.7mmol/L視為糖尿病模型制備成功，造模未成功的大鼠繼續補充注射鏈脲佐菌素72h，最終30只大鼠均造模成功。造模成功后的大鼠均在第2d注射褪黑素，其中，低劑量褪黑素組大鼠每天左下腹腔注射褪黑素10mg/kg，高劑量褪黑素組大鼠每天左下腹腔注射褪黑素20mg/kg[4-6]，正常對照組和糖尿病組大鼠不做任何治療，每日1次，連續喂養12wk。

1.2.2取材及視網膜病理改變的觀察大鼠過量麻醉處死，在解剖顯微鏡下無菌操作取右眼眼球，分離視網膜組織，分成2份。其中，1份視網膜用于HE染色，另1份視網膜浸于DMEM培養液中，4℃保存以備用。HE染色具體方法：4%多聚甲醛固定24h，制備石蠟切片并染色蘇木素5～10min，蒸餾水沖洗后伊紅染液5～10min，再次用蒸餾水洗去玻片浮色，梯度乙醇溶液脫水后觀察視網膜病理改變。大鼠左側眼球置于戊二醛(2.5%)固定液內，4℃冰箱固定72h以上，留作制備電鏡標本。

1.2.3電鏡觀察視網膜神經節細胞層細胞改變取出戊二醛固定液中眼球，分離視網膜組織，室溫下1%鋨酸固定2h，丙酮脫水，常規電鏡包埋，制作超薄切片，枸櫞酸鉛和2%醋酸雙氧鈾染色，透射電鏡觀察。

1.2.4視網膜組織中SOD及MDA水平檢測各組取50μg視網膜組織，研磨制成組織勻漿后低速離心(2 000r/min)，取上清液，按照檢測試劑盒說明將樣品加樣、混勻，采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD及MDA水平。

1.2.5 Western Blot檢測Bcl-2、Bax及P53的蛋白表達水平取50μg視網膜組織，冰上加入400μL含有蛋白酶抑制劑的裂解液研磨30min以提取總蛋白，10 000r/min離心10min后取上清，行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后5%的脫脂奶粉4℃封閉2h，加一抗(稀釋濃度1∶1000)過夜，室溫下孵育二抗(稀釋濃度1∶2000)1h，ECL化學發光法自顯影并采集圖像，利用樣本目的蛋白的光密度比內參條帶的光密度，比較不同樣本的相對表達率。

2結果

2.1 HE染色觀察大鼠視網膜結構正常對照組大鼠視網膜組織結構清晰，內、外核層細胞排列規整；糖尿病組大鼠視網膜組織層次欠清晰，神經纖維層水腫，內叢狀層及內、外核層排列疏松；低劑量褪黑素組視網膜細胞分層基本分明，層間細胞排列較整齊，內外核層排列稍紊亂；高劑量褪黑素組大鼠視網膜組織結構較低劑量褪黑素組進一步改善，見圖1。

2.2電鏡觀察大鼠視網膜神經節細胞超微結構改變正常對照組大鼠視網膜神經節細胞胞漿豐富，細胞核結構清晰，核內染色質均勻；糖尿病組大鼠視網膜神經節細胞胞漿顯著減少，細胞核腫脹，染色質稀疏，線粒體腫脹并呈空泡樣改變；褪黑素組大鼠視網膜神經節細胞形態不同程度改善，其中，低劑量褪黑素組細胞內仍可見線粒體空泡樣改變，細胞核形態略規整；高劑量褪黑素組胞漿豐富，細胞核形態規則，核仁結構清晰，見圖2。

2.3各組大鼠視網膜組織中SOD及MDA水平如表1所示，與正常對照組相比，糖尿病組大鼠視網膜組織中SOD水平明顯降低，MDA水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與糖尿病組相比，低劑量褪黑色素組和高劑量褪黑色素組SOD水平明顯升高，MDA水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。

圖1 光學顯微鏡下各組大鼠視網膜結構 (HE染色×400) A:正常對照組;B:糖尿病組;C:低劑量褪黑素組;D高劑量褪黑素組。

圖2 電鏡觀察大鼠視網膜神經節細胞超微結構改變(×5 000) A:正常對照組;B:糖尿病組;C:低劑量褪黑素組;D高劑量褪黑素組。

圖3 Western blot檢測各組視網膜組織中Bcl-2、Bax及P53蛋白表達。

表1 各組大鼠視網膜組織中SOD及MDA水平

2.4各組大鼠視網膜組織凋亡蛋白表達水平比較如圖3和表2所示，與正常對照組相比，糖尿病組大鼠視網膜組織Bcl-2蛋白表達明顯降低，Bax和P53蛋白表達明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與糖尿病組比較，低、高劑量褪黑素組Bcl-2蛋白表達明顯升高，高劑量褪黑素組Bax及P53蛋白表達明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠視網膜組織凋亡相關蛋白檢測結果

3討論

褪黑素可直接淬滅活性氧自由基，有良好的抗氧化應激、抗炎、抗凋亡活性[7-9]。李曉艷等[10]研究表明，褪黑素對糖尿病大鼠具有神經保護作用，其作用機制與抑制視網膜神經細胞凋亡有關。褪黑素具有脂溶性和水溶性，細胞膜及線粒體膜均由脂質構成，這種雙重溶解性的特點允許藥物可以有效通過血-眼屏障及血-房水屏障，在眼部發揮足夠的藥效[11]。本研究也是利用了褪黑素雙重溶解的特點，以無水乙醇溶解褪黑素，保證藥物充分溶解又能達到有效作用濃度。此外，褪黑素由松果體分泌，具有無毒特性，應用于眼部相對安全，這些特性為褪黑素用于視網膜疾病的臨床實驗研究奠定了基礎[12]。在本實驗中我們采用腹腔注射的方式給藥，是考慮到視網膜組織供血來自頸外動脈，大鼠每天左下腹腔注射褪黑素后，可通過體循環-左心室-主動脈-頸外動脈-眼動脈方式到達視網膜組織，保證了視網膜整體組織藥物的有效性?，F階段我們通過體內實驗證實了該藥物對視網膜組織的保護作用，后續將繼續通過局部用藥方式(眼內注射或滴眼劑)，進一步證實該藥物有效性。

視網膜由視網膜神經上皮層及RPE層構成，RPE層由單層排列的RPE細胞構成，任何原因引起的RPE損傷都會對視功能造成不可逆影響[13]。視網膜對氧化應激高度敏感，糖尿病患者視網膜組織氧化應激水平升高，影響了視網膜神經上皮層及RPE層的正常生理功能[14]。本研究使用60mg/kg鏈脲佐菌素大鼠腹腔內注射建立糖尿病大鼠模型，觀察褪黑素對視網膜組織的保護作用。

觀察結果顯示，褪黑素干預的糖尿病大鼠，其視網膜形態結構要優于糖尿病組大鼠。糖尿病組大鼠視網膜組織層次欠清晰，神經纖維層水腫，內叢狀層及內、外核層排列疏松；褪黑素干預后，視網膜各層細胞排列較規整；電鏡對視網膜神經節細胞超微結構觀察顯示，低、高劑量褪黑素組細胞形態及細胞內線粒體空泡樣改變均較糖尿病組減輕，表明褪黑素干預可保護正常視網膜結構。

SOD及MDA是機體內主要的抗氧化酶，其中，SOD與自由基清除能力正相關，MDA含量高低可反映自由基水平[15]。本實驗證實，褪黑素干預糖尿病大鼠能夠提高SOD水平，降低MDA含量，從而減輕病理狀態下的組織氧化損傷。

Bcl-2在氧化應激介導的細胞凋亡反應中起重要作用，是調節線粒體凋亡途徑的重要分子，具有潛在的抗凋亡作用[16]。Bax及P53表達水平的高低直接反應細胞凋亡程度[17]。糖尿病組大鼠視網膜組織內Bcl-2表達降低，Bax及P53表達升高，表明鏈脲佐菌素可誘導組織凋亡；褪黑素干預后Bcl-2表達增加，Bax及P53表達降低，進一步證實褪黑素可抑制高糖誘導的視網膜組織凋亡。

關于褪黑素對糖尿病大鼠視網膜組織保護作用的研究并不多見。國內學者通過制備2型糖尿病大鼠模型，研究褪黑素對視網膜組織的保護作用，結果顯示，褪黑素能有效減輕糖尿病大鼠視網膜局部氧化應激反應，抑制視網膜神經細胞凋亡[18]。本研究通過觀察視網膜組織結構，檢測視網膜組織中SOD、MDA、Bcl-2、Bax、及P53表達水平進一步驗證了褪黑素對高糖誘導的視網膜組織損傷的保護作用，為預防和治療糖尿病視網膜病變提供了新的干預措施。