BHMT對同型半胱氨酸誘導的人晶狀體上皮細胞氧化損傷的保護作用

周海燕，薛雨順，嚴 宏，李 迪，王新川

0引言

晶狀體蛋白質是晶狀體內重要的結構蛋白，晶狀體蛋白質結構發生變化、溶解度改變，凝集、交聯均可導致光散射和晶狀體透明度改變，進而引起視力下降。大量的研究已證實蛋氨酸(Methionine，Met)對維持晶狀體透明度是非常重要的，甜菜堿高半胱氨酸甲基轉移酶(betaine-homocysteine methyl transferase，BHMT)是Met循環中重要的酶。BHMT主要在肝臟和腎皮質中有較大量表達，它利用同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)和提供甲基的甜菜堿(betaine，Bet)催化Met的再合成[1-2]。前期我們利用基于同位素相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)標記的蛋白質組學技術研究分析了不同年齡人白內障晶狀體核與透明晶狀體核間的差異蛋白質，并首次報道了BHMT在高齡組白內障晶狀體核區的水平較年輕組明顯下調，進一步通過新的臨床白內障晶狀體標本進行了驗證[3]。但其在晶狀體老化和白內障形成中如何參與代謝等確切機制尚不清楚。已有研究發現，高Hcy是導致年齡相關性疾病的重要風險因素[4]。除此，還與多種眼部疾病相關[5]。在白內障的研究中，高水平的Hcy與年齡相關性白內障發病密切相關[6-7]。本研究利用BHMT基因過表達人晶狀體上皮細胞(HLEC)進行研究，觀察Hcy干預下細胞中內質網應激蛋白、ROS及抗氧化系統相關酶水平及凋亡相關酶Caspase-12的變化，探討BHMT在高濃度Hcy環境下對晶狀體的保護作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞和儀器與試劑HLEC-B3細胞、胎牛血清(FBS，Ausbian)、DMEM(Corning)、胰酶(上海生工生物工程股份有限公司)、Puromycin(Clontech)、D-Hanks(上海吉凱基因技術有限公司),BCA蛋白定量檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(中國碧云天公司)、乳酸脫氫酶試劑、抗-GRP78試劑盒(Abcam,Cambridge,MA)、Caspase-12檢測試劑盒(Abcam,Cambridge,MA)、抗-Nrf2試劑盒(Santa Cruz Biotechnology,USA),同型半胱氨酸化合物(梯希愛化成工業發展有限公司)。熒光顯微鏡(奧林帕斯)、CO2培養箱(日本三洋)、倒置顯微鏡(上海蔡康光學儀器有限公司)、離心機(賽默飛世爾科技有限公司)、生物安全柜(上海振樣創空氣凈化設備有限公司)，GV358載體，AgeI/AgeI酶切(上海吉凱基因化學技術有限公司)，EdU試劑盒(C10310銳博)。

1.1.2分組將HLEC隨機分為3組。正常組：正常HLEC+10% FBS培養基；對照組：感染了空載體的HLEC+10% FBS培養基+5mmol/L Hcy；BHMT過表達組：BHMT過表達病毒感染HLEC+10% FBS培養基組+5mmol/L Hcy。根據Velazquez等的實驗方法[8]，孵育24h后檢測相關指標。

1.2方法

1.2.1 BHMT基因過表達慢病毒載體的構建基因BHMT(NM_001713)由上海吉凱基因化學技術有限公司合成,所擴增的BHMT基因條帶大小為1 262bp，插入經AgeI/AgeI酶切的GV358慢病毒載體構建GV358-BHMT慢病毒質粒,將重組慢病毒質粒GV358-BHMT,pHelper1.0載體，pHelper2.0混合液稀釋后，利用Lipofactamin 2000脂質體對HEK293T細胞進行轉染，48h后收集細胞并采用Western blotting法檢測BHMT表達情況，裂解細胞提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，經SDS-PAGE分離后電轉移至PVDF膜上,一抗(1∶500)孵育過夜后給予二抗(1∶1000)孵育，漂洗后加入配置好的顯色液用ECL法結合X光片顯色。

1.2.2 BHMT基因過表達慢病毒載體感染細胞根據1.2.1構建BHMT基因過表達慢病毒載體，轉染HEK293T細胞后48～72h進行病毒收獲,確定采用相應的濃縮純化得到高滴度的慢病毒保存液,病毒感染HLEC-B3后，通過抗性篩選獲得過表達慢病毒感染細胞株，提取mRNA，經過qPCR檢測表達水平。BHMT上游引物序列：5’-CCACTTTGACCCCACCATTA-3’；下游引物序列：5’-GCTAGCTCATTTGTGGTCATC-3’。以GAPDH基因為內參照基因，采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。

1.2.3細胞增殖能力的測定EdU細胞增殖實驗方法：取對數生長期細胞，以每孔2 000細胞接種于96孔板中，培養至正常生長階段；制備適量50μmol/L EdU培養基；每孔加入100μL 50μmol/L EdU培養基孵育2h，棄培養基；PBS清洗細胞2次，每次5min；每孔加入50μL細胞固定液(即含4%多聚甲醛的PBS)室溫孵育30min，棄固定液。每孔加入50μL 2mg/mL甘氨酸，脫色搖床孵育5min后，棄甘氨酸溶液；每孔加入100μL PBS，脫色搖床清洗5min，棄PBS；每孔加入100μL 1×Apollo染色反應液，避光、室溫、脫色搖床孵育30min后，棄染色反應液；加入100μL滲透劑(0.5% TritonX-100的PBS)脫色搖床清洗2～3次，每次10min，棄滲透劑；每孔每次加入100μL甲醇清洗1～2次，每次5min；PBS清洗1次，每次5min；去離子水按100∶1的比例稀釋試劑F，制備適量1×Hoechst 33342反應液，避光保存；每孔加入100μL 1×Hoechst 33342反應液，避光、室溫、孵育30min；棄染色反應液；加入100μL PBS清洗2次；染色后立即進行熒光顯微鏡觀測。

1.2.4氧化損傷標志物檢測

1.2.4.1檢測ROS含量培養的細胞加入DCFH-DA熒光探針于培養基，濃度為10μmol/L。37℃孵育細胞30min，收集細胞,37℃避光30min,流式細胞儀檢測。

1.2.4.2測定GSH活性用可見分光光度計(波長420nm)測算組織中谷胱甘肽(GSH)活性：取各組樣本0.5mL，加應用液2mL混勻，3 500～4 000r/min離心10min，取上清液1mL進行顯色反應。混勻，靜置5min，420nm處，1cm光徑，蒸餾水調零比色測各管OD值。

1.2.4.3 Western blotting檢測細胞內質網應激相關蛋白及凋亡相關蛋白(GPR78,Nrf2，Caspase-12)接收細胞樣品，PBS洗滌2次后，適量預冷的2×Lysis Buffer裂解，刮下細胞轉移入EP管中，冰上裂解10～15min后超聲破碎細胞，取上清BCA法測定蛋白濃度。加樣進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜及脫脂牛奶封閉，按照不同檢測試劑盒比例加入一抗(1∶1000)，之后于4℃冰箱內與一抗孵育過夜，室溫漂洗后按照比例加入二抗(1∶10000)，孵育1h，再次漂洗后加入配置好的顯色液，于Bio-Rad發光成像儀顯色。蛋白質表達量以“目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值”表示。

2結果

2.1 Western blotting檢測BHMT蛋白表達情況重組慢病毒質粒轉染HEK293T細胞48h后，BHMT慢病毒轉染組細胞BHMT蛋白表達水平明顯高于正常組和空載體轉染組(圖1),表明BHMT基因過表達慢病毒載體構建成功。

2.2 qPCR檢測BHMT mRNA表達情況采用BHMT基因過表達慢病毒載體感染HLEC-B3細胞后進行實時定量PCR檢測，所得結果與GAPDH的結果相比較，通常認為Ct值相差2以上即存在顯著差異。本實驗中正常組為1.0032±0.090，空載體感染組為1.475±0.047，BHMT慢病毒感染組為986.181±106.033，差異有統計學意義(P<0.05,圖2)，BHMT基因表達豐度明顯升高，約是正常組的986.181倍，空載體感染組與正常組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 BHMT基因過表達對HLEC增殖能力的影響利用EdU試劑盒對HLEC進行增殖能力檢測，正常組、對照組、過表達組細胞增殖能力分別為(33.342±0.045)%、(28.099±0.307)%、(58.141±0.192)%，差異有統計學意義(F=38.726,P<0.05)。與正常組相比,過表達組細胞增殖比例増加,差異有顯著統計學意義(P<0.01),而對照組與正常組相比,差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

2.4 BHMT基因過表達對氧化損傷指標的影響細胞內ROS水平：使用流式細胞儀行DCFH-DA定量檢測顯示,正常組、對照組、過表達組細胞內ROS水平分別為(89.2043±0.3511)%、(91.4502±0.0606)%、(49.5625±0.4502)%,差異有統計學意義(F=99.348,P<0.05)。與正常組相比,過表達組ROS降低,差異有顯著統計學意義(P<0.01),而對照組與正常組相比,差異無統計學意義(P>0.05)，見圖4。

2.5 BHMT高表達對HLEC內GSH活性的影響各組GSH活性結果見表1。三組間GSH活性差異有統計學意義(F=93.375,P<0.05)。與正常組相比,過表達組GSH活性増加,差異有顯著統計學意義(P<0.01),而對照組與正常組相比,差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 Western blotting檢測BHMT蛋白表達。

圖2 qPCR檢測BHMT mRNA表達情況 aP<0.05 vs正常組。

圖3 各實驗組細胞增殖比例 aP<0.05 vs正常組。

表1 各實驗組GSH活性

2.6 Western blotting檢測GRP78、Nrf2、Caspase-12在各組表達的差異三組GRP78相對表達量分別為1.1081±0.031、1.2433±0.020、0.2282±0.013，正常組及對照組明顯高于過表達組，差異均有統計學意義(P<0.05)；正常組、對照組、過表達組Nrf2的相對表達量分別為0.1061±0.047、0.1081±0.040、0.8276±0.070，正常組與對照組明顯低于過表達組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖5。正常組、對照組、過表達組凋亡相關酶Caspase-12的相對表達量分別為0.3032±0.055、0.8781±0.043、0.1026±0.050，過表達組與正常組明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖6，表2。

3討論

前期我們利用iTRAQ標記的蛋白質組學技術研究分析了不同年齡人白內障晶狀體核與透明晶狀體核間的差異蛋白質,并首次報道了BHMT在高齡組白內障晶狀體核區的水平較年輕組明顯下調，進一步通過新的臨床白內障晶狀體標本進行了驗證[3]。但其在晶狀體老化和白內障形成中如何參與代謝等確切機制尚不清楚。在胎兒晶狀體文庫中，BHMT是一個大量表達的基因[9]。Rao等[10]第一次在恒河猴的晶狀體核中發現了BHMT，其表達約占核部總蛋白的0.5%～10%，但具體機制不清。BHMT是Met循環中重要的酶,它利用Hcy和提供甲基的甜菜堿(betaine，Bet)催化Met的再合成[11-12]，是機體在生理狀況下維持Hcy穩定代謝水平的重要功能蛋白質。實驗研究已經觀察到Hcy對人類和動物晶狀體上皮細胞的影響，高濃度Hcy可以誘導晶狀體細胞發生嚴重的氧化應激反應，引起白內障的發生和發展[7,13]。Hcy升高導致大量的活性氧的產生，誘導細胞死亡和凋亡,可能導致了皮質性白內障的形成[14]。而后囊下白內障的形成可能與玻璃體內Hcy的含量增多有關[15]。研究認為Hcy是一種引起白內障的內質網應激源。內質網應激是指由于內質網中鈣離子紊亂和蛋白質不能正常折疊導致細胞內質網內穩態失衡、生理功能發生紊亂的一種亞細胞器的病理過程,葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein78,GRP78)是內質網應激反應的標志性蛋白[16]。細胞內抵御過量ROS損傷的最重要機制是由PERK依賴的轉錄激活因子(NF-E2-related factor2,Nrf2)調控的[17-18]。Nrf2調控許多抗氧化防御基因，包括GR、谷胱甘肽-s-轉移酶、硫氧還蛋白、硫氧還蛋白還原酶及另外的抗氧化酶。研究發現在相同的誘導條件下BHMT轉基因小鼠的高Hcy血癥發病率明顯低于對照組，并可保護肝臟細胞免受高同半胱氨酸濃度的損傷[19-20]。Zhang等[21]發現兩種miRNAs通過分化靶向海刺參中BHMT來直接影響體腔細胞中Hcy含量，靶基因BHMT siRNA或補充Hcy均可明顯促進體腔細胞ROS的產生，表明靶基因BHMT通過調控Hcy的含量發揮生物學功能。

圖4 各實驗組細胞內ROS水平。

圖5 GRP78，Nrf2在各組表達的Western blotting分析。

圖6 Caspase-12在各組表達的Western blotting分析。

表2 各組細胞內相關蛋白質表達

前期我們成功構建了人晶狀體上皮細胞BHMT基因過表達慢病毒載體，在實驗中觀察到空載體感染組及BHMT慢病毒感染組的細胞增殖率及活性未出現抑制現象[22]。然后觀察其對Hcy干預的人晶狀體上皮細胞的氧化損傷的抑制作用。本研究發現，當加入Hcy干預后，BHMT過表達細胞內ROS水平較正常組及對照組明顯降低，GSH活性明顯升高，提示BHMT可以在細胞接受高Hcy刺激后，減輕細胞的氧化損傷程度。Nrf2的降低也進一步說明了對照組細胞內抵御過量ROS損傷的屏障削弱。內質網應激反應標志性蛋白GRP78的表達較陰性對照組明顯降低，提示高Hcy啟動了內質網應激反應，而BHMT可有效地抑制這種反應，增強細胞的保護作用，同時抑制了凋亡相關酶Caspase-12的表達。

綜上所述，由于Hcy誘導了內質網應激反應的啟動,并導致晶狀體上皮細胞中ROS的產生,ROS降低了游離谷胱甘肽的數量,削弱了氧化防御系統，加劇了更加氧化的環境,導致晶狀體發生氧化損傷。而BHMT可以抑制Hcy對細胞的氧化損傷作用，減少細胞ROS水平，升高GSH活性，減輕內質網應激反應，抑制了細胞凋亡，最終表現為可以有效防護高Hcy環境下晶狀體上皮細胞氧化損傷。證明了其在防治與Hcy有關的疾病方面的積極作用，為白內障氧化損傷機制提供新的依據。