喹諾酮化合物的抗乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒活性

張姝，李紅，馮連順，劉明亮，郭慧元,*

(1 武漢譜尼科技有限公司，武漢 430014;2 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050)

1 前言

慢性乙型肝炎(簡(jiǎn)稱乙肝)和丙型病毒性肝炎(簡(jiǎn)稱丙肝)分別是由于感染乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)引起的病毒性肝炎，乙肝和丙肝患者及HBV和HCV攜帶者是主要傳染源[1,2]。HBV可通過(guò)母嬰、血和血液制品、破損的皮膚黏膜及性接觸傳播，而HCV主要經(jīng)輸血、針刺和吸毒等途徑傳播[3,4]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球約有3.25億人感染了HBV或HCV，二者合在一起是發(fā)生肝硬化和肝癌的最常見(jiàn)原因[5]。病毒性肝炎是全球第七大死亡原因，每年因此喪命的患者超過(guò)100萬(wàn)，與結(jié)核病和艾滋病毒導(dǎo)致的死亡人數(shù)相當(dāng)。我國(guó)約有9000萬(wàn)HBV和4500萬(wàn)HCV攜帶者，2000萬(wàn)乙肝和1000萬(wàn)丙肝患者，肝癌病例占全球一半[5]。世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)，2015至2030年間，中國(guó)將有約1000萬(wàn)人因肝硬化和肝癌死亡。顯然，乙肝和丙肝已成為嚴(yán)重的社會(huì)和公共衛(wèi)生問(wèn)題。因此，對(duì)乙肝和丙肝的防治顯得尤為重要。

目前，抗乙肝和丙肝藥物主要有干擾素和核苷類似物等[6]。然而，干擾素和核苷類似物有諸多缺點(diǎn)，如干擾素需注射使得患者的依從性不高，而核苷類似物停藥后復(fù)發(fā)率較高[7,8]。不僅如此，隨著抗病毒藥物的廣泛使用，HBV和HCV對(duì)藥物的敏感性呈逐年下降之勢(shì)。多個(gè)抗乙肝和丙肝藥物正處于臨床評(píng)價(jià)階段，但仍不能滿足患者的需求[9]。因此，有必要研發(fā)新型抗乙肝和丙肝藥物。

喹諾酮可分為2-喹諾酮和4-喹諾酮，其衍生物具有抗菌[10,11]、抗結(jié)核[12,13]、抗腫瘤[14,15]、抗瘧疾[16-18]、抗人類免疫缺陷病毒(HIV)[19,20]、抗HBV和HCV[21-23]等多種生物活性，且藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和安全性良好，在臨床上有著廣泛的應(yīng)用。不僅如此，喹諾酮結(jié)構(gòu)骨架可供修飾的位點(diǎn)較多，在發(fā)現(xiàn)全新結(jié)構(gòu)骨架愈發(fā)困難的今天，喹諾酮類化合物已成為研究人員競(jìng)相開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)[24-26]。

近年來(lái)，研究人員對(duì)喹諾酮進(jìn)行了系統(tǒng)而廣泛的結(jié)構(gòu)修飾，喹諾酮的生物活性譜不斷拓展，構(gòu)-效關(guān)系(SAR)不斷完善。本文將著重介紹近年來(lái)喹諾酮類化合物在抗HBV和HCV領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展，并歸納此類藥物的SAR，以啟迪科學(xué)家設(shè)計(jì)活性更高的候選物。

2 2-喹諾酮衍生物

與4-喹諾酮相比，2-喹諾酮研究的相對(duì)較少[27]。然而，2-喹諾酮衍生物也具有多種生物活性，且某些2-喹諾酮類化合物如viridicatin、viridicatol和tipifarnib目前正處于臨床評(píng)價(jià)階段，有望于不久的將來(lái)為人類健康服務(wù)[28]。Guo等評(píng)價(jià)了2-喹諾酮化合物1及其C-3位取代衍生物2～4在HBV感染HepG2.2.15細(xì)胞中的體外抗HBV e抗原(HBeAg)、抗HBV表面抗原(HBsAg)和抗HBV復(fù)制脫氧核糖核酸(DNA)活性，發(fā)現(xiàn)所有化合物對(duì)HBsAg均具有潛在的抑制活性，半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.056～2.84 mmol/L，但多數(shù)化合物對(duì)HBeAg的活性不高(IC50: 0.079～＞6.00 mmol/L)[29,30]。SAR研究結(jié)果表明，化合物2(IC50: 0.074～0.950 mmol/L)和4(IC50:0.079～1.87 mmol/L)對(duì)HBsAg和HBeAg均具有較高的活性，而化合物1(IC50: ≥2.22 mmol/L)和3(IC50: ＞3.61 mmol/L)對(duì)HBeAg的活性較弱，提示2-喹諾酮母核C-3位取代基對(duì)活性有顯著影響且羥乙基和乙酰胺基對(duì)活性有利，游離氨基則對(duì)活性不利。細(xì)胞毒性研究結(jié)果顯示，與無(wú)取代(1, 細(xì)胞半數(shù)毒性濃度/CC50:1.25～＞5.46 mmol/L)和羥乙基(2, CC50: 1.72～＞4.91 mmol/L)衍生物相比，向C-3位引入氨基或乙酰胺基可提高對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的毒性(化合物3和4的CC50: 0.044～0.767 mmol/L)[29]。其中，代表物2c對(duì)HBsAg (IC50: 70.2 μmol/Lμmol/L)、HBeAg (IC50: 340.5μmol/L)和HBV復(fù)制DNA(IC50: 72.1μmol/Lol/L)具有良好的活性，抗HBsAg和HBeAg活性優(yōu)于對(duì)照藥替諾福韋(IC50: 1450.1和1160.2 μmol/L)[30]。

圖1 2-喹諾酮衍生物1～10的化學(xué)結(jié)構(gòu)

進(jìn)一步研究表明，向化合物2c的N-1位引入甲基(5a, IC50: 22和34μmol/L)、烯丙基(5b, IC50: 10和12μmol/L)和苯基(5c, IC50: 12和12μmol/L)可提高抗HBsAg和HBeAg活性，但2,6-二氟苯基(5d, IC50: 87和＞2300μmol/L)的引入對(duì)活性不利[31,32]。遺憾的是，化合物5a～c(CC50: 34, 23和26 μmol/L)對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的毒性顯著提高。用烷基或芳基羧酸將C-3位的羥乙基酯化(6)可增強(qiáng)活性，但對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的毒性也隨之提高。含有不飽和雙鍵的酯7～10普遍具有良好的體外抗HBsAg和HBeAg活性，絕大多數(shù)衍生物的IC50＜60μmol/L，且SI＞21，選擇性良好[32]。SAR顯示，含有苯基的不飽和酯7和9的活性優(yōu)于吡啶基和烷基衍生物8和10。苯環(huán)上甲氧基的位置與活性息息相關(guān)，且間位＞鄰位＞對(duì)位，而第二個(gè)甲氧基的引入并不能顯著提高活性。連接子的長(zhǎng)度對(duì)抗HBsAg和HBeAg活性有一定影響，如對(duì)化合物7d (IC50: 10和26μmol/L)、9a (IC50: 11和18μmol/L)和9b (IC50: 20和28μmol/L)而言，短鏈連接子對(duì)抗HBeAg活性有利。代表物7d對(duì)HBsAg (SI＞135)、HBeAg (SI＞51)和HBV復(fù)制DNA (IC50: 45μmol/L)具有良好的活性和選擇性，抗HBsAg和HBeAg活性是對(duì)照拉米夫定(IC50:27000和30000μmol/L)的2700和1153倍，極具進(jìn)一步開(kāi)發(fā)前景[32]。

HCV NS5B蛋白編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)是HCV復(fù)制酶復(fù)合體的關(guān)鍵催化酶，是潛在的抗HCV藥物作用靶點(diǎn)[33]。2-喹諾酮-4H-苯并[e][1,2,4]噻二嗪1,1-二氧化物具有良好的抗HCVRdRp活性，引起了藥物化學(xué)家的關(guān)注[34]。絕大多數(shù)2-喹諾酮-4H-苯并[e][1,2,4]噻二嗪1,1-二氧化物11抑RdRp和HCV亞基因組復(fù)制子(Huh-7細(xì)胞)活性在納摩爾級(jí)[35]。其中，代表物11a～d抑RdRp和HCV亞基因組復(fù)制子的IC50和EC50分別為10～47 nmol/L和38～417 nmol/L，被用于進(jìn)一步研究在小鼠、犬及猴子模型中的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明，化合物11d在小鼠(靜脈注射/iv:1.3 mg/kg, 口服給藥/po: 3.4 mg/kg)、犬(iv: 0.8 mg/kg,po: 4.0 mg/kg)及猴子(iv: 0.8 mg/kg, po: 4.0 mg/kg)模型中的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)良好：藥峰濃度(Cmax)為4141,4455和5437 ng/mL，半衰期(T1/2)為182.2, 103.5和96.9 min，清除率(CL)為1.4, 0.86和0.76 mL/min/kg，穩(wěn)定分布容積(Vdss)為0.36, 0.15和0.11 L/kg，口服生物利用度(F%)為44%, ＞35%和＞53%。極高的活性加之良好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，使得化合物11d極具進(jìn)一步開(kāi)發(fā)前景。

進(jìn)一步研究顯示，將雜合體11（圖2）的N-1位烷基換成氮取代的烷基或芳基(12)或把喹諾酮環(huán)換為萘啶酮(13)所得的雜合體也具有良好的抑HCV NS5B聚合酶Ia和Ib亞基因活性[36]。大部分目標(biāo)物的IC50在納摩爾級(jí)，但與雜合體11相比，并未有顯著提高。向苯并[e][1,2,4]噻二嗪1,1-二氧化物結(jié)構(gòu)片段引入取代基對(duì)活性有顯著影響，尤其是雜合體14和15抗HCV NS5B聚合酶Ia和Ib亞基因的抑制活性在納摩爾水平[37]。總體而言，雜合體15的活性優(yōu)于14，提示胺基比醚對(duì)活性有利。對(duì)含氧衍生物14而言，化合物14h (IC50: 46和16 nmol/L )的活性最高，而向酰胺上引入甲基(14f, IC50: 180和80 nmol/L )或二甲基(14e,IC50: 934和70 nmol/L)均會(huì)導(dǎo)致活性的降低。對(duì)含氮衍生物15而言，所有的磺酰胺衍生物15e～h (IC50:2～41 nmol/L )均顯示出具有優(yōu)秀的抑HCV NS5B聚合酶Ia和Ib亞基因活性。藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明，雜合體14h (5 mg/kg)的生物利用度為35%、Cmax為180 nmol/L，藥-時(shí)曲線下面積(AUC)為2.54 mg·h/mL，CL為0.74 L/h/kg，T1/2為2 h。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該化合物可以在肝部累積，在給藥8 h，該化合物在肝部的濃度為血漿的54倍。用苯并[b][1,4]噻嗪1,1-二氧化物(16)替換苯并[e][1,2,4]噻二嗪1,1-二氧化物將導(dǎo)致抑HCV NS5B聚合酶Ia和Ib亞基因活性的大幅下降，化合物16的IC50在微摩爾級(jí)[38]。進(jìn)一步研究顯示，盡管絕大多數(shù)六氫2-喹諾酮衍生物17的抑HCV NS5B聚合酶Ia和Ib亞基因活性也在納摩爾水平，但藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)有所降低[39]。

圖2 2-喹諾酮衍生物11～18的化學(xué)結(jié)構(gòu)

從青花椒樹(shù)皮中分離出的2-喹諾酮衍生物18抑HBV病毒DNA活性較弱，IC50為30.8 μg/mL，但細(xì)胞毒性低(ED50: ＞200 μg/mL)，可作為先導(dǎo)物進(jìn)一步優(yōu)化[40]。

3 4-喹諾酮衍生物

4-喹諾酮具有生物活性譜廣、藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和安全性良好等諸多優(yōu)點(diǎn)，目前臨床上使用的喹諾酮類藥物絕大多數(shù)屬于4-喹諾酮[41,42]。因此，4-喹諾酮一直是該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。4-喹諾酮衍生物如諾氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星和巴洛沙星等可通過(guò)抑制HCV NS3促旋酶抑制HCV復(fù)制[43]，故從4-喹諾酮衍生物中尋找新型抗HCV和HBV藥物引起了藥物化學(xué)家的極大關(guān)注。

氟喹諾酮(諾氟沙星/環(huán)丙沙星/洛美沙星/加替沙星)-5-氟靛紅-甲氧芐氨嘧啶雜合體19（圖3）在濃度為50 μg/mL對(duì)HUH-7胞內(nèi)HCV RNA復(fù)制抑制率為89%～100%[44]。SAR顯示抑制活性與氟喹諾酮的種類相關(guān)，順序?yàn)榄h(huán)丙沙星(100%)＞諾氟沙星(95%)＞加替沙星(92%)＞洛美沙星(89%)。將靛紅C-5位的氟替換為甲基(20, 在濃度為50 μg/mL對(duì)HUH-7胞內(nèi)HCVRNA復(fù)制抑制率分別為97%, 92%和65%)對(duì)活性無(wú)顯著影響[45]。盡管環(huán)丙沙星-5-氟靛紅-甲氧芐氨嘧啶雜合體19b的活性最高，但對(duì)HUH-7細(xì)胞的毒性也最高，CC50＜50 μg/mL，仍需進(jìn)一步優(yōu)化[44]。

圖3 氟喹諾酮-靛紅-甲氧芐氨嘧啶雜合體19和20的化學(xué)結(jié)構(gòu)

對(duì)4-喹諾酮衍生物21（圖4）的抑HCV亞基因組復(fù)制子(Huh-7)活性評(píng)價(jià)結(jié)果表明，向其C-7位引入取代基將導(dǎo)致活性的消失[46]。N-1位無(wú)取代或引入正丙基或芐基衍生物也未顯示出任何活性，但引入羥乙基或羥丙基則對(duì)活性有利。對(duì)C-6位而言，苯并呋喃-2-基和苯并噻吩-2-基最優(yōu)。活性最高的21a～d對(duì)HCV復(fù)制子也具有潛在的抑制活性(EC50: 5.8～36 μmol/L)，其中化合物21b,c (EC50: 5.9和5.8 μmol/L)抑HCV復(fù)制子活性優(yōu)于利巴韋林(EC50: 14 μmol/L)。進(jìn)一步與研究發(fā)現(xiàn)，這類化合物對(duì)NS5B的抑制活性較弱，提示此類化合物可能通過(guò)其它途徑發(fā)揮抗HCV活性。

除化合物22a和22h外，所有衍生物(IC50: 40～154 nmol/L)抑HCV NS5BRdRp均在納摩爾級(jí)別[47]。SAR顯示，將C-7位的氯(22a～c, IC50: 154～1410 nmol/L)換成哌嗪基(22d, IC50: 67 nmol/L)、4-甲基哌嗪基(22e,IC50: 40 nmol/L)和4-(2-吡啶基)哌嗪基(22f, IC50: 69 nmol/L)和4-(2-噻唑基)哌嗪基(22d, IC50: 138 nmol/L)對(duì)活性有利，但替換為4-(3-三氟甲基苯基)哌嗪基(22h, IC50: 6132nmol/L)則對(duì)活性不利。化合物22a和22d～g對(duì)HCV復(fù)制子(Huh5-2細(xì)胞)也具有潛在的抑制活性，EC50為1.5～8.6 μmol/L。其中，化合物22f不僅對(duì)HCV復(fù)制子的活性良好(EC50: 2.2 μmol/L, EC90:13.5 μmol/L)，而且對(duì)Huh-9-13細(xì)胞未顯示出任何毒性(CC50: ＞163 μmol/L, SI＞54)，可作為先導(dǎo)物進(jìn)一步優(yōu)化。

對(duì)化合物23～25的抑HCV聚合酶活性研究結(jié)果表明，這些化合物普遍具有良好的活性，且25＞＞23＞24[48]。所有4-喹諾酮衍生物25對(duì)HCV聚合酶的抑制活性均極高，IC50為8～60 nmol/L。SAR顯示，苯環(huán)上甲磺酰基的位置對(duì)活性有顯著影響，且對(duì)位＞鄰位＞間位。其中，代表物25d (IC50: 8 nmol/L)的活性極高，可作為先導(dǎo)物進(jìn)一步優(yōu)化。該課題組進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，某些C-3位含有噁唑、噁二唑、四氮唑或噁唑啉結(jié)構(gòu)片段的喹諾酮也具有潛在的活性[49]。以喹諾酮-噁二唑雜合體26為例，噁二唑環(huán)上的取代基對(duì)活性有顯著影響，且芐基遠(yuǎn)優(yōu)于苯基和苯乙基。其中，噁二唑環(huán)上含有芐基的衍生物26b和26d抑HCV聚合酶IC50分別為41和23 nmol/L，遠(yuǎn)優(yōu)于苯基和苯乙基衍生物(IC50: ＞10 μmol/L)。化合物26d的活性優(yōu)于26b，提示6-氟-7-(4-甲基)哌嗪基優(yōu)于6,7-二甲氧基。該課題組進(jìn)一步優(yōu)化得到了6-氟-7-(4-甲基)哌嗪喹諾酮-噁二唑雜合體27和28并研究了它們的抑HCV聚合酶活性，發(fā)現(xiàn)這類雜合體的活性極高，IC50低至14～75 nmol/L[49]。SAR顯示，雜合體27的活性優(yōu)于相應(yīng)的28。其中，雜合體27d,e抑HCV聚合酶IC50分別為14和15 nmol/L，抑HCV復(fù)制子EC50分別為250和230 nmol/L，極具進(jìn)一步開(kāi)發(fā)前景。

圖4 喹諾酮衍生物21～28的化學(xué)結(jié)構(gòu)

一般而言，向4-喹諾酮的C-2位引入取代基會(huì)影響喹諾酮與拓?fù)洚悩?gòu)酶IV和DNA促旋酶的結(jié)合，進(jìn)而影響抗菌活性[50,51]。然而，研究顯示，2-取代-4-喹諾酮衍生物如化合物29（圖5）也具有良好的抗HCV活性，提示拓?fù)洚悩?gòu)酶IV和DNA促旋酶可能并非這類化合物抗HCV的結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)4-喹諾酮衍生物29的抑HCV基因分型2a亞型(Huh7.5.1細(xì)胞)活性測(cè)定結(jié)果表明，目標(biāo)物的EC50為0.4～11.1 μmol/L[52]。SAR顯示，向哌嗪的N-4位引入甲基比芐基更優(yōu)。其中，化合物29f (EC50: 0.4 μmol/L)的活性最高，值得進(jìn)一步優(yōu)化。某些C-2位含有對(duì)氟苯基的喹諾酮衍生物30也具有潛在的活性，其活性主要取決于N-1位取代基[53]。SAR顯示，N-1位為環(huán)丙基(30a, EC50: 4.1 μmol/L)或烯丙基(30b, EC50: 9.47 μmol/L)對(duì)活性有利，而無(wú)取代或異丙基、芐基和環(huán)己基取代的衍生物則未顯示出任何活性。有趣的是，酯基衍生物的活性遠(yuǎn)優(yōu)于相應(yīng)的羧酸衍生物，這與抗菌活性大相徑庭。

圖5 C-2位含有取代基的喹諾酮衍生物29和30的化學(xué)結(jié)構(gòu)

從狹葉蕓香提取所得的山小橘堿(31)和pseudane IX (32)具有潛在的抗HCV活性（圖6），IC50分別為6.4和1.4 μmol/L[54]。進(jìn)一步研究顯示，化合物32可通過(guò)降低HCV RNA復(fù)制水平和抑制病毒蛋白質(zhì)的合成而誘導(dǎo)HCV凋亡。化合物33～37也具有潛在的抑制HCV復(fù)制活性(Huh-7細(xì)胞)，EC50為0.96～202.7 μmol/L[55-57]。其中，化合物33e,f (EC50: 0.96和0.98 μmol/L)抑HCV復(fù)制活性最高，優(yōu)于利巴韋林(EC50: 17.6 μmol/L)。值得一提的是，化合物33f對(duì)Huh-7細(xì)胞未顯示出任何毒性，CC50＞1000 μmol/L，可作為先導(dǎo)物進(jìn)一步優(yōu)化。

4 結(jié)束語(yǔ)

病毒性肝炎是全球第七大死亡原因，每年因此死亡的人數(shù)與結(jié)核病和艾滋病毒導(dǎo)致的死亡人數(shù)相當(dāng)。未來(lái)20年內(nèi)與病毒性肝炎相關(guān)的死亡將繼續(xù)增加，其中乙肝和丙肝對(duì)患者的健康和生命危害極大，已成為嚴(yán)重的社會(huì)和公共衛(wèi)生問(wèn)題。近年來(lái)，隨著抗病毒藥物的廣泛使用，HBV和HCV對(duì)藥物的敏感性不斷下降。為克服耐藥性，同時(shí)降低毒性、提高療效，亟需研發(fā)新型抗乙肝和丙肝藥物。

圖6 喹諾酮衍生物31～37的化學(xué)結(jié)構(gòu)

喹諾酮類化合物具有多種生物活性，且藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和安全性良好，在臨床上有著廣泛的應(yīng)用。近年來(lái)，研究人員對(duì)喹諾酮進(jìn)行了系統(tǒng)而廣泛的結(jié)構(gòu)修飾，生物活性譜不斷拓展，構(gòu)-效關(guān)系不斷完善。研究發(fā)現(xiàn)，喹諾酮類化合物是潛在的抗乙肝和丙肝候選物。其中的某些化合物如7d對(duì)HBsAg、HBeAg和HBV復(fù)制DNA具有良好的活性和選擇性，抗HBsAg和HBeAg活性是對(duì)照拉米夫定的2700和1153倍，而化合物11d具有極高的體外活性和良好的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，極具進(jìn)一步開(kāi)發(fā)前景。本文著重介紹了近年來(lái)喹諾酮類化合物在抗HBV和HCV領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展，并歸納此類藥物的SAR，以啟迪科學(xué)家設(shè)計(jì)活性更高的候選物。