超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜對糧谷產品中20種真菌毒素的快速篩查和確證

胡巧茹, 曹 鵬, 叢中笑, 梁君妮, 沙美蘭, 李曉玉, 尹大路, 魯 閩

(煙臺海關技術中心, 山東 煙臺 264000)

真菌毒素(mycotoxins)也叫霉菌毒素,是產毒真菌在適宜環境條件下的次級代謝產物,具有生物毒性。截至目前已分離得到100多種真菌,可產生大約300種有毒的次級代謝產物[1]。農產品中常見的真菌毒素有黃曲霉毒素(aflatoxin)、赭曲霉毒素(ochratoxin)、玉米赤霉烯酮(zearalenone)、伏馬毒素(fumonisin)、雜色曲霉素(sterigmatocystin)、單端孢霉烯族毒素(trichothecenes)以及橘青霉素(citrinin)等。糧谷類農作物在種植過程中和貯藏期間容易受到真菌的侵染,導致真菌毒素污染情況普遍存在[2]。由于近年來受全球氣候變暖、干旱等因素的影響,世界各國真菌毒素暴露事件屢見不鮮,特別是糧谷產品中多種真菌毒素混合污染現象頻頻發生[3-6],真菌毒素多殘留檢測受到越來越多的關注和重視。

目前,真菌毒素采用的檢測方法主要是酶聯免疫法(ELISA)[7]、薄層層析色譜法(TIC)[8]、氣相色譜法(GC)[9]、氣相色譜串聯質譜法(GC-MS)[10]、液相色譜法(HPLC)[11,12]、液相色譜串聯質譜法(HPLC-MS/MS)[13-17]等。其中ELISA法具有特異性強、靈敏度高、前處理簡單、無需昂貴儀器、易于推廣等優點,該方法存在一定的假陽性,只能作為一種篩選法[7]。TIC法在確證新發現真菌毒素和檢測方法學研究方面,具有一定的優越性,但此法精確度低、操作過程復雜,在檢測領域的應用受到限制,通常只能做定性試驗以及粗略的定量試驗[8]。GC和GC-MS技術常用于分析熱穩定、易揮發性的化合物,但大多數真菌毒素對熱不穩定,主要用來檢測單端孢霉烯族化合物[9,10],分析種類有限。HPLC采用紫外或熒光檢測器可用于大多數真菌毒素的分析,具有穩定可靠、靈敏度高等特點,是近年來真菌毒素檢測的主流方法,但該方法通常需要結合免疫親和柱凈化[11,12],檢測費用高,檢測目標單一。HPLC-MS/MS具有靈敏度高、適合多組分同時分析等特點,在真菌毒素檢測方面的應用研究較多[13-17],但HPLC-MS/MS為低分辨質譜,難以完全闡明化合物的結構裂解信息,可能產生假陽性現象,在處理復雜基質樣品中多種目標篩查物時,具有一定的局限性。近年來,高分辨質譜(HRMS)發展迅速,在此基礎上建立的液相色譜-高分辨質譜聯用的分析技術在痕量多組分檢測方面得到越來越多的重視和應用[18-20],它能夠在超高分辨率下測定化合物及其碎片離子的精確分子質量,具有較強的抗干擾能力,適用于高通量篩查及目標化合物的確證分析。

本研究運用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀測定糧谷產品中20種真菌毒素。樣品經乙腈(含2%(體積分數,下同)甲酸)提取、Captiva EMR-Lipid小柱凈化,在正、負離子同掃模式下,以甲醇-乙腈(1∶1, v/v)作為有機相、5 mmol/L甲酸銨水溶液作為水相,進行梯度洗脫,采用Thermo Hypersil Gold C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm)分離,以高分辨質譜(Q-Exactive)的一級質譜全掃描加數據依賴的二級質譜掃描方式(Full MS/dd MS2)進行篩查和確證。該方法準確高效,重現性好,可實現對糧谷產品中20種真菌毒素的快速篩查分析,滿足大通量檢測要求。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀Q-Exactive、UltiMate 3000高效液相色譜儀,Thermo Hypersil Gold C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm)(美國Thermo Fisher Scientific公司); Captiva EMR-Lipid凈化柱(3 mL,美國Agilent公司); 3K15離心機(德國Sigma公司);DL-5C低速大容量離心機(上海安亭科學儀器廠); OA-SYS氮吹儀(美國Organomation公司); Milli-Q超純水純化系統(美國Millipore公司);渦旋混合器(德國IKA公司)。

黃曲霉毒素B1標準品溶液(aflatoxin-B1,質量濃度為2.0 mg/L)、黃曲霉毒素B2標準品溶液(aflatoxin-B2,質量濃度為0.5 mg/L)、黃曲霉毒素G1標準品溶液(aflatoxin-G1,質量濃度為2.0 mg/L)、黃曲霉毒素G2標準品溶液(aflatoxin-G2,質量濃度為0.5 mg/L)購自美國Trilogy公司;黃曲霉毒素M1(aflatoxin M1,純度為99.8%)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,純度為99.6%)、3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-acetyl deoxynivalenol,純度為99.0%)、15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-acetyl deoxynivalenol,純度為99.0%)、赭曲霉毒素A(ochratoxin-A,純度為99.9%)、黃曲霉毒素M2(aflatoxin M2,純度為99.0%)、玉米赤霉烯酮(zearalenone,純度為99.0%)、黃綠青霉素(citreoviridin,純度為98.0%)、蛇形菌素(diacetoxyscirpenol,純度為98.0%)、伏馬毒素B1標準品溶液(fumonisin B1,質量濃度為99.7 mg/L)、伏馬毒素B2標準品溶液(fumonisin B2,質量濃度為100 mg/L)、伏馬毒素B3標準品溶液(fumonisin B3,質量濃度為100 mg/L)、HT-2毒素(HT-2 toxin,純度為99.0%)、T-2毒素(T-2 toxin,純度為98.0%)、雜色曲霉素(sterigmatocystin,純度為99.2%)均購自美國Achemtek公司,桔青霉素標準品溶液(citrinin,質量濃度為10 g/L)購自以色列Fermentek公司。

乙腈和甲醇(色譜純,德國Merck公司);甲酸(色譜純,美國Dikma公司);甲酸銨(色譜純,上海麥克林公司);無水硫酸鎂和氯化鈉(優級純,天津科密歐公司)。

1.2 樣品前處理

準確稱取5.00 g樣品于50 mL聚丙烯具塞離心管中,加入10 mL水,渦旋混勻,再加入10 mL乙腈(含2%甲酸)、4 g硫酸鎂和1.5 g氯化鈉,振蕩提取10 min,在4 ℃條件下,以5 000 r/min的速度離心5 min,移出8 mL上層乙腈相,加入2 mL水,渦旋混合。取3 mL萃取液上樣到Captiva EMR-Lipid凈化柱,使其在重力作用下流過凈化柱并收集凈化液,待萃取液完全流過后,加壓排空凈化柱。取2.5 mL凈化液于40 ℃水浴中氮吹至近干,用5 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)-乙腈溶液(5∶5, v/v)定容至1 mL,充分混勻后,過0.22 μm有機相濾膜,進樣分析。

1.3 色譜-質譜條件

1.3.1液相色譜條件

Thermo Hypersil Gold C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm);柱溫:40 ℃;進樣量:10 μL。流動相:A為5 mmol/L甲酸銨水溶液,B為乙腈-甲醇(1∶1, v/v);流速:0.35 mL/min。梯度洗脫條件:0～0.8 min, 2%B; 0.8～3.0 min, 2%～24%B; 3.0～4.0 min, 24%B; 4.0～6.0 min, 24%～95%B; 6.0～9.0 min, 95%B; 9.0～9.5 min, 95%B～2%B; 9.5～12.0 min, 2%B。

1.3.2質譜條件

加熱電噴霧離子源(HESI)溫度:350 ℃;毛細管電壓:3.5 kV;離子傳輸管溫度:320 ℃;鞘氣流速:40 unit;輔助氣流速:10 unit; Full MS/dd MS2掃描模式:采集范圍為100～800m/z,正負離子同時采集;一級質譜分辨率為70 000,二級質譜分辨率為17 500;歸一化碰撞能量(NCE)為30、45和60 eV。

2 結果與討論

2.1 前處理方法

2.1.1提取溶劑的選擇

因為本研究所檢測的真菌毒素種類較多,需要兼顧各類目標待測物的提取效率。真菌毒素常用的提取試劑有乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、正己烷、二氯甲烷等,考察不同提取劑對目標物的提取效果,其中甲醇、乙腈對各種真菌毒素均有較好的提取效率,優于其他幾種提取劑。乙腈為極性較強的低毒溶劑,具有優良的溶解性,對大多數非極性和部分極性真菌毒素有較高的提取率,并可促使蛋白質變性沉淀,提高提取效率[21],因此本研究選用乙腈(或乙腈體系)作為提取劑。部分真菌毒素對pH、極性范圍比較敏感,可在提取時加入輔助試劑增強聯合提取效果,研究[22-25]發現乙腈作為提取劑加入甲酸可以提高伏馬毒素、赭曲霉毒素等的提取效果,經過實驗優化最終選擇乙腈(含2%甲酸)作為提取液,各種目標待測物均取得了良好的提取效果。

2.1.2凈化劑條件的優化

四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀分辨率高、抗干擾能力強,能有效避免假陽性的發生,對于樣品的凈化處理要求相對較低,考慮到復雜的樣品基質會對色譜柱以及質譜檢測器等造成一定污染、縮短壽命,因此對樣品提取液進行進一步凈化處理。目前多種真菌毒素檢測的凈化方式主要是采用QuEChERS技術[21,26,27]和多功能凈化柱[28-30]。QuEChERS技術中常用的凈化劑為乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、C18(或十八烷基硅烷鍵合相吸附劑(ODS))、氰丙基鍵合硅膠(-CN)、胺丙基鍵合硅膠(-NH2)等,這些凈化劑可通過極性相互作用或非極性相互作用使目標物和雜質相互分離,實驗中發現,PSA、GCB、C18、-CN和-NH2幾種凈化劑單一或組合對樣品基質進行凈化時,均存在對部分真菌毒素的吸附作用,其中采用PSA和C18對大部分真菌毒素的吸附影響較小,但赭曲霉毒素A的回收率偏低,吸附效應明顯。常用的真菌毒素多功能凈化柱有Mycosep 226柱和MycoSpin 400柱,其原理是提取液通過不同類型的吸附劑裝填而成的柱體,通過填料的選擇性吸附作用吸附雜質,達到凈化的目的。鄭翠梅等[28]在研究中發現使用Mycosep 226柱時,會吸附伏馬毒素FB1、伏馬毒素FB2和赭曲霉毒素A。葉金等[31]采用直接提取稀釋法與MycoSpin 400柱凈化方法進行回收率試驗,結果顯示MycoSpin 400對于赭曲霉毒素A、伏馬毒素FB1、伏馬毒素FB2及3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的回收率不高,影響定量結果的準確性。本研究在參考文獻和綜合實驗結果的基礎上采用Captiva EMR-Lipid柱進行凈化處理,Captiva EMR-Lipid柱結合體積排阻和疏水作用兩種機制,在允許目標分析物通過的同時捕獲脂質等雜質,試驗結果顯示,采用Captiva EMR-Lipid柱進行凈化處理后,20種真菌毒素無明顯吸附,且操作過程簡便,無需活化洗脫程序,直接過濾有效地降低了基質干擾,達到預期凈化目的。

2.2 色譜條件的優化

2.2.1色譜柱的選擇

對比了Thermo Hypersil Gold C18(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm)超高效色譜柱與普通C18柱的分析效果。結果表明,普通的色譜柱柱效偏低,不能保證每種目標物都有較好的峰形,而且分析時間長;Thermo Hypersil Gold C18柱采用亞微米填料技術,具有更高的分離度,更快的分析速度,該柱在較短的時間內,梯度洗脫分析出20種真菌毒素,且各目標化合物的保留良好,峰形對稱。

2.2.2流動相的選擇和優化

在流動相的選擇中,對比了用乙腈和甲醇作為有機相以及水、甲酸銨水、甲酸水作為水相對20種真菌毒素分離的影響。試驗結果顯示,有機相采用甲醇時,黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素M1、黃曲霉毒素G2和黃曲霉毒素M2的分離效果差,難以實現基線分離,有機相采用乙腈時,大部分目標分析物信號強度降低。綜合考慮,采用甲醇-乙腈(1∶1, v/v)作為有機相。為提高檢測通量,分析時采用正負離子切換方式,20種真菌毒素的優勢加合離子不同,采用甲酸銨水溶液可有效得到[M+H]+、[M+NH4]+、[M-H]-、[M+HCOO]-等多種準分子離子;在甲酸銨水溶液中加入甲酸,雖然可提高[M+H]+的響應強度,但[M-H]-的離子強度顯著降低,對玉米赤酶烯酮的檢出靈敏度影響較大。結合實驗條件,最終選用5 mmol/L甲酸銨的水溶液作為水相,通過優化梯度洗脫程序,目標化合物得到了最佳分離。20種真菌毒素標準溶液的提取離子流色譜圖見圖1。

2.3 質譜條件優化

本研究采用高分辨質譜的一級質譜全掃描加數據依賴的二級質譜掃描方式(Full MS/dd MS2)。鑒于不同真菌毒素的結構性質不同,分析時采用正負離子切換方式提高檢測通量。黃曲霉毒素B、G、M族,黃綠青霉素,桔青霉素,伏馬毒素,赭曲霉毒素A和雜色曲霉素正離子模式下響應高,母離子為[M+H]+;蛇形菌素和T-2毒素正離子模式下響應高,母離子為[M+NH4]+;玉米赤霉烯酮負離子模式下響應高,母離子為[M-H]-; HT-2毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰衍生物負離子模式下響應高,母離子為[M+HCOO]-。首先在分辨率為70 000下對20種目標物進行一級質譜全掃描,將理論精確質量數與實際測量質量數的誤差控制在5×10-6范圍內,當母離子強度達到設定閾值(1×106)時,自動觸發二級質譜掃描,同時得到母離子的精確質量數以及二級質譜的全掃描信息。20種真菌毒素的質譜參數見表1。

2.4 方法學考察

2.4.1方法的線性范圍和檢出限

采用空白樣品基質溶液準確配制不同質量濃度的混合標準工作液,經高分辨質譜檢測,以色譜峰面積(Y)為縱坐標、對照溶液的質量濃度(X, μg/L)為橫坐標繪制標準曲線。高分辨質譜使用目標物的精確質量數提取,基線噪音很低,信噪比往往無窮大,因此不采用以3倍信噪比(S/N)確定化合物檢出限、10倍信噪比確定化合物定量限(LOQ)的方法,而是用向空白樣品中逐級降低加標濃度,以各目標物在線性范圍中滿足回收率值在60%～120%區間內的最低濃度為方法的定量限。結果表明,20種真菌毒素在相應濃度范圍內呈良好的線性關系,相關系數(r2)均>0.99,定量限為0.25～20 μg/kg,可滿足檢測要求。20種真菌毒素的線性范圍、線性方程、r2和定量限見表2。

2.4.2回收率和精密度

選取空白小麥、玉米樣品,分別添加低、中、高3個不同濃度水平的混合標準溶液,按1.2節進行前處理,每個水平重復測定6次,計算其回收率和相對標準偏差(RSD)。如表3所示，20種目標化合物的回收率為72.9%～117.8%, RSDs為2.9%～15.2%。該方法具有較好的回收率和重復性,可以滿足糧谷產品中20種真菌毒素日常監測的要求。

圖 1 20種真菌毒素混合標準溶液的提取離子流色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of mixed standard solution of 20 mycotoxins

表 1 20種真菌毒素的質譜參數Table 1 Mass parameters for the 20 mycotoxins

表 220種真菌毒素的線性范圍、線性方程、r2和定量限

Table 2Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r2), and limits of quantitation (LOQs) of the 20 mycotoxins

CompoundLinear range/(μg/L)Linear equationr2LOQ/(μg/kg)Aflatoxin B11.0-20Y=1.056×107X+1.004×1060.99951.0Aflatoxin B20.25-5.0Y=3.245×106X-3.226×1050.99920.25Aflatoxin G11.0-20Y=1.234×107X-3.214×1060.99931.0Aflatoxin G20.25-5.0Y=1.574×107X-1.226×1060.99900.25Aflatoxin M11.0-20Y=4.158×106X+2.462×1060.99931.0Aflatoxin M21.0-20Y=5.668×106X-2.473×1050.99971.0Zearalenone5.0-100Y=4.246×106X-5.467×1050.99875.0Citreoviridin5.0-100Y=3.289×107X+2.145×1060.99895.0Citrinin5.0-100Y=4.356×106X+2.445×1050.99855.0Deoxynivalenol5.0-100Y=2.589×106X-4.321×1050.99555.03-Acetyl deoxynivalenol20-400Y=5.214×107X+2.789×1060.99812015-Acetyl deoxynivalenol20-400Y=5.265×106X-5.241×1050.998020Diacetoxyscirpenol1.0-20Y=1.286×107X-3.245×1060.99941.0Fumonisin B110-200Y=2.455×107X-1.548×1060.999310Fumonisin B210-200Y=5.228×106X+3.126×1060.998910Fumonisin B310-200Y=6.594×106X-3.717×1050.998710HT-2 toxin5.0-100Y=4.385×106X+5.429×1050.99925.0Ochratoxin-A1.0-20Y=1.488×107X-2.528×1060.99961.0Sterigmatocystin1.0-20Y=2.865×106X-6.421×1050.99911.0T-2 toxin5.0-100Y=4.659×106X+1.478×1060.99935.0

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

表 320種真菌毒素在小麥和玉米樣品中的加標回收率和相對標準偏差(n=6)

Table 3Spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the 20 mycotoxins in the wheat and corn samples (n=6)

CompoundSpiked level/(μg/kg)WheatRecovery/%RSD/%CornRecovery/%RSD/%CompoundSpiked level/(μg/kg)WheatRecovery/%RSD/%CornRecovery/%RSD/%Aflatoxin B1189.56.988.77.63-Acetyl 2079.77.481.29.2291.65.494.28.0deoxynivalenol4094.76.589.46.71096.85.297.24.920091.04.290.26.3Aflatoxin B20.25102.17.496.88.615-Acetyl 2087.59.576.86.70.590.34.888.96.7deoxynivalenol4084.76.284.54.32.596.85.1103.67.220090.55.887.95.7Aflatoxin G1189.27.895.38.5Diacetoxyscirpenol190.65.489.04.6296.26.590.26.4294.53.293.54.41092.66.093.44.61097.82.896.53.8Aflatoxin G20.2594.49.195.88.6Fumonisin B11080.08.976.89.30.5101.66.5104.35.42074.57.777.59.22.5117.84.0107.14.210079.87.484.25.8Aflatoxin M1185.75.686.87.2Fumonisin B21073.87.684.211.2294.74.389.96.72081.66.389.67.51091.02.993.66.310079.86.976.45.1Aflatoxin M2187.55.690.37.7Fumonisin B31075.58.577.85.0284.74.984.24.32084.94.984.64.61092.54.488.96.710088.05.280.94.2Zearalenone585.68.288.47.6HT-2 toxin582.75.478.97.61089.86.491.28.71092.64.280.85.65090.55.687.64.45084.73.691.44.4Citreoviridin575.410.677.49.4Ochratoxin A189.73.688.05.41078.98.974.88.7295.44.187.64.75080.26.581.66.81092.32.295.13.8Citrinin572.911.375.610.2Sterigmatocystin174.66.577.27.01075.910.178.46.2287.66.978.65.25079.87.574.94.61082.25.284.54.6Deoxynivalenol5116.815.2109.810.4T-2 toxin587.55.584.98.410109.410.3114.27.21091.74.688.75.250104.58.197.85.35095.63.292.65.3

2.5 實際樣品分析

采用本文建立的方法對52份玉米、小麥、大米等樣品進行分析,其中5份樣品中檢出黃曲霉毒素B1和B2, 2份樣品檢出玉米赤霉烯酮,1份樣品中檢出脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。

以一份檢出黃曲霉毒素B1的玉米樣品為例,將樣品采集數據中的母離子精確質量數、保留時間以及二級碎片離子信息等與建立的譜庫進行對比,進行20種真菌毒素的快速篩查,并對篩查出的黃曲霉毒素B1進行確證和準確定量。黃曲霉毒素B1的提取離子色譜圖和二級質譜圖見圖2和圖3。

圖 2 (a)標準溶液和(b)陽性樣品中黃曲霉毒素B1的提取離子色譜圖Fig. 2 Extracted ion chromatograms of aflatoxin B1 in (a) the standard solution and (b) the positive sample

圖 3 (a)標準溶液和(b)陽性樣品中黃曲霉毒素B1的二級質譜圖Fig. 3 MS2 spectra of aflatoxin B1 in (a) the standard solution and (b) the positive sample

3 結論

本研究利用高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜,快速篩查和確證了糧谷產品中20種真菌毒素。高分辨質譜保證了復雜樣品中基質干擾的消除,顯著提高了目標物定性和定量結果的準確性。該方法快速、靈敏、準確,可滿足糧谷產品中真菌毒素的大通量快速篩查和確證。