基于揮發性組分的氣相色譜指紋圖譜評價沉香化氣片質量

青旺旺, 施宇濤, 楊 林, 張芮騰, 張景勍, 何 丹*

(1. 重慶醫科大學藥學院, 重慶 400016; 2. 重慶醫藥高等專科學校藥學院, 重慶 401331)

沉香化氣片收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準中藥成方制劑》第七冊[1],全方由沉香、木香、廣藿香、香附、砂仁、陳皮等10味藥組成,具有理氣疏肝、消積和胃的功效,用于治療肝胃氣滯、脘腹脹痛、胸膈痞滿、不思飲食、噯氣泛酸。其中木香、廣藿香、砂仁和陳皮4味藥材蒸餾提取揮發油后入藥。廣藿香揮發油具有抗炎、抗菌、鎮咳及調節胃腸道的功能[2,3],百秋李醇為廣藿香的主要揮發性成分,也是廣藿香質量評價的指標成分;砂仁揮發油具有明顯的消炎鎮痛、抗氧化、促進胃腸運動等多方面的功效[4],其主要成分為樟腦和乙酸龍腦酯;陳皮性溫、味苦、辛,陳皮揮發油具有很好的促胃動力作用[5]。沉香化氣片中的揮發性成分具有良好的藥理作用,但目前沉香化氣片現行質量標準僅有性狀和顯微鑒別項,而國內外關于沉香化氣片含量測定的文獻報道多見于采用高效液相色譜法測定橙皮苷的含量和氣相色譜-質譜聯用測定百秋李醇、樟腦、乙酸龍腦酯等成分的含量[6-9],同時也有采用超高效液相色譜法建立沉香化氣丸的指紋圖譜[10],但采用氣相色譜法建立沉香化氣片中揮發性成分的氣相色譜指紋圖譜的文獻尚未見報道,難以全面體現其質量的優劣。因此,有必要建立沉香化氣片的氣相色譜指紋圖譜。

中藥復方制劑具有組成藥材多、組成成分復雜的特點,中藥指紋圖譜能夠充分提取中藥制劑中的化學成分信息,具有整體性和全面性,通過指紋圖譜方法能在一定程度上反映復方的內在質量[11-13],而化學模式識別既可以對指紋圖譜的信息進行識別、處理,又可以將多個指標進行綜合、降維和分類分析,從而更加客觀、科學地反映中藥制劑的質量信息,最終達到全面控制該制劑的整體質量的目的[14,15]。本實驗擬建立沉香化氣片的氣相色譜指紋圖譜,并結合相似度評價和化學模式識別,為該制劑的質量控制與評價提供科學的依據。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

氣相色譜儀(GC-2010)、氣相色譜-質譜聯用儀(GCMS-TQ8040)配電子轟擊(EI)源(日本島津公司); 1/10萬電子分析天平(SQP,賽多利斯科學儀器有限公司);超聲波清洗器(KQ-2200B,昆山市超聲儀器有限責任公司), Agilent DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱(美國Agilent公司)。

甲醇(色譜純,美國天地有限公司),乙醇(分析純,重慶川東化工集團有限公司), D-檸檬烯對照品(純度>98%,批號Z28D8H51809,上海源葉生物科技有限公司),乙酸龍腦酯對照品和百秋李醇對照品(純度均>98%,批號分別為MUST-18022605和MUST-17073111,成都曼斯特生物科技有限公司),正十八烷(純度>99%,批號G9814,山東西亞化學股份有限公司), 20批沉香化氣片(批號分別為18030026、18020015、18010007、18020013、18030029、18030024、18020012、18030019、18030023、17120095、18040031、18020016、18030022、18030027、17070058、18040033、18010006、18040030、18030021和17060049,依次記為S1～S20,太極集團)。

1.2 對照溶液的制備

內標溶液:精密稱取正十八烷適量,加甲醇制得濃度為32.6 mg/L的正十八烷內標溶液。

對照品溶液:精密稱取D-檸檬烯、乙酸龍腦酯、百秋李醇對照品適量,加甲醇分別制成質量濃度為61.54、37.5和53.3 mg/L的對照品溶液,即得。

1.3 供試品溶液的制備

取10片沉香化氣片,研勻,精密稱定0.5 g,置于具塞錐形瓶中,加入10 mL乙醇,稱量,超聲(頻率40 Hz,功率100 W)處理30 min,放冷,再稱定質量,用乙醇補足減少的重量,搖勻,靜置,取上清液經濾紙濾過,將濾液過0.22 μm有機相微孔濾膜,取續濾液1 mL置于5 mL量瓶中,精密加入0.5 mL內標溶液,加乙醇至刻度,搖勻,即得。

1.4 色譜條件

1.4.1氣相色譜條件

色譜柱:Agilent DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)柱;載氣:氮氣;進樣口溫度:250 ℃;進樣模式:分流;分流比:5∶1。程序升溫:初始溫度為60 ℃,保持2 min,以2.5 ℃/min的速率升溫至250 ℃,保持10 min。平衡時間:3 min; FID檢測器溫度:250 ℃;進樣量:1 μL。

1.4.2質譜條件

離子源:EI源;離子源溫度:200 ℃;接口溫度:250 ℃;載氣:氦氣;溶劑延遲:2.5 min;掃描范圍:m/z45～500。

2 結果與討論

2.1 內標參照峰的選擇

選擇在氣相色譜儀和氣相色譜-質譜聯用儀上檢測性質穩定、定量準確、易于獲得的烷烴。以正十八烷標準品溶液進樣分析,所得譜圖與樣品譜圖重疊比較,對共有峰無干擾,選擇正十八烷為內標參照峰,如圖1所示。

圖 1 (a)正十八烷及(b)沉香化氣片樣品的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of (a) the n-octadecane and (b) the Chenxianghuaqi tablet sample Peak Nos. 1-11: components 1-11; T: n-octadecane.

2.2 樣品提取方法的考察

樣品以超聲提取法、回流提取法、冷浸法進行提取,根據各成分的結構和性質,發現超聲提取法和回流提取法均優于冷浸法,考慮到一些揮發性成分的熱不穩定,且超聲提取法簡便快捷,故選擇超聲提取法。對提取溶劑(甲醇、乙醇、水、30%(體積分數,下同)甲醇、50%甲醇和80%甲醇)進行考察,結果表明乙醇對待測成分的提取優于甲醇,故選擇乙醇為提取溶劑。對提取時間(30、45和60 min)進行了考察,結果表明提取時間≥45 min時,提取效果無明顯差異,故選擇提取時間為45 min。

2.3 含量測定

分別精密吸取適量對照品溶液和適量內標溶液,加甲醇稀釋成6個不同水平濃度的對照品溶液,按1.4.1節方法進樣測定,3個組分在各自的范圍內線性關系良好,相關系數(r)均不小于0.999。以3個組分的峰面積RSD來評價定量分析的精密度、重復性和穩定性,RSD均小于3%,滿足定量分析的要求。20批樣品中,D-檸檬烯的含量為0.802～5.490 mg/g,乙酸龍腦酯的含量為0.074～0.218 mg/g,百秋李醇的含量為0.140～0.732 mg/g。各組分含量的差異可能是所用原藥材的成分波動和生產過程的波動所導致的。

2.4 氣相指紋圖譜的分析

2.4.1方法學考察

在精密度試驗中,精密吸取1 μL S1樣品供試品溶液,按1.4.1節方法連續進樣6次,記錄氣相色譜圖。在穩定性試驗中,分別在S1樣品供試品溶液制備后0、2、4、8、12和24 h精密吸取1 μL,按1.4.1節方法進樣測定,記錄氣相色譜圖。在重復性試驗中,取S1樣品,按供試品溶液制備方法平行制備6份,分別精密吸取1 μL,按1.4.1節方法進樣測定,記錄氣相色譜圖。分別計算精密度試驗、穩定性試驗、重復性試驗各共有峰相對于參照峰(內標峰)的相對保留時間和相對峰面積。

精密度試驗、穩定性試驗、重復性試驗的各共有峰相對保留時間RSDs和相對峰面積的RSDs的結果分別為小于1%和小于3%、小于1%和小于3%、小于1%和小于4%。將精密度試驗、穩定性試驗、重復性試驗的圖譜分別采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012版)進行處理,精密度試驗、穩定性試驗、重復性試驗分別6次進樣的圖譜與對照圖譜相似度均不小于0.99,因此,表明儀器精密度良好,供試品溶液在24 h內穩定,該方法的重復性良好。

圖 2 20批沉香化氣片的氣相色譜指紋圖譜和對照指紋圖譜Fig. 2 Gas chromatographic fingerprints of the 20 batches of Chenxianghuaqi tablets and the reference fingerprint (R) S1-S20: sample 1-20.

2.4.2氣相色譜指紋圖譜的建立

取20批沉香化氣片樣品,按供試品溶液制備方法制備溶液,按1.4.1節方法進樣測定,記錄氣相色譜圖。對所有色譜圖進行統一積分后,將所得圖譜以AIA格式導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012版)軟件進行處理,對照圖譜的生成方法為中位數法,時間窗寬度為0.1,運用多點校正方法對色譜圖進行全峰匹配,生成對照指紋圖譜(R)和20批樣品的氣相色譜指紋圖譜圖(見圖2),確定了11個共有峰。

2.5 氣相色譜-質譜聯用對指紋圖譜峰定性

應用氣相色譜-質譜聯用技術,對沉香化氣片指紋圖譜中的11個共有峰進行了初步定性,氣相色譜-質譜條件見1.4節,沉香化氣片樣品的總離子流色譜圖見圖3,再利用計算機內解卷積軟件[16,17]及匹配NIST14質譜庫,最終經對照品比對、NIST14譜庫檢索和文獻檢索,對其中了10個成分進行了指認,對應氣相色譜圖中的8號峰未能指認,結果見表1。

2.6 指紋圖譜的相似度評價

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012版)軟件,將S1樣品的色譜圖作為參照圖譜,計算20批沉香化氣片指紋圖譜的相似度。結果各共有峰保留時間的RSDs均<0.14%,各共有峰峰面積的RSDs相差較大,20批樣品的相似度為0.952～0.999,相似度結果見表2。表明沉香化氣片的化學組成成分相似,但各批次間共有峰成分含量差異較大,如需要更為客觀地反映沉香化氣片的內在質量,須進行化學模式識別。

圖 3 沉香化氣片樣品的總離子流色譜圖Fig. 3 Total ion current chromatogram of the Chenxianghuaqi tablet sample Peak Nos: 1. D-limonene; 2. camphor; 3. bornyl acetate; 4. 4,7-methanoazulene; 5. α-bulnesene; 6. patchouli alcohol; 7. n-hexadecanoic acid; 9. octadecanoic acid; 10. pentafluoropropionyl-L-prolin-pentyl ester; 11. triphenylphosphine oxide.

表 1 氣相色譜指紋圖譜中10個共有峰的指認Table 1 Identification of the 10 common peaks in gas chromatographic fingerprints

Standard: standard products.

表 2 20批沉香化氣片氣相色譜指紋圖譜相似度結果Table 2 Similarity results for the gas chromatographic fingerprints of the 20 batches of Chenxianghuaqi tablets

2.7 化學模式識別

2.7.1聚類分析

將20批樣品的11個共有峰的絕對峰面積作為變量,得到20×11階原始數據矩陣,導入SPSS 20.0數據分析軟件中,選取組間連接法,以歐式距離作為樣品測定,計算樣品的相似性程度,對樣品進行系統聚類分析,結果見圖4。

圖 4 20批沉香化氣片的聚類分析樹狀圖Fig. 4 Cluster analysis dendrogram of the 20 batches of Chenxianghuaqi tablets

由圖4可知,20批樣品聚為2類,樣品S17、S4、S3、S10、S14、S16、S19、S1、S2、S6、S8、S7、S20、S15聚為1類,樣品S18、S13、S9、S5、S12、S11聚為1類。第1類樣品批次生產日期差異較大,第2類樣品批次生產日期較為接近,因此聚為一類。在制劑的生產過程中,其質量穩定性受到多種因素共同影響,不同的生產時間是導致制劑質量差異的重要因素之一。主要原因可能是原藥材采摘季節不同以及不同時間的車間生產工藝、質量體系均會產生不同的影響,因此導致制劑批次之間的質量也會有所差異。

圖 5 沉香化氣片的主成分分析得分圖Fig. 5 Scores of principal component analysis for Chenxianghuaqi tablets

2.7.2主成分分析

圖 6 沉香化氣片的主成分載荷圖Fig. 6 Loading plot of principal component for Chenxianghuaqi tablets Nos. are the same as those in Fig. 3

將20批樣品的11個共有峰的峰面積輸入Excel表格內,得到20×11列數據矩陣,導入SIMCA-P 13.0軟件中進行主成分分析,得到前3個主成分的累計方差貢獻率為86.4%,超過85%,沉香化氣片的主成分分析得分圖和載荷散點圖,見圖5和圖6。由圖5可知,20批沉香化氣片樣品可分為為2組,樣品S15、S16、S1、S19、S3、S10、S2、S4、S14、S7聚為1類,樣品S20、S17、S8、S18、S6、S9、S5、S13、S11、S12聚為1類。由圖6可知,載荷散點圖中每一個點代表一個色譜峰,表示每個色譜峰對主成分綜合作用的貢獻,距離載荷圖原點越遠的變量,權重越大,代表該色譜峰對樣本整體分布所起的作用就越大,圖中1號(D-檸檬烯)、2號(樟腦)、3號(乙酸龍腦酯)、4號(4,7-methanoazulene)、5號(α-布藜烯)色譜峰在坐標系中的絕對值較大,表明其對藥物的整體質量起主要作用。

3 結論

本文建立了沉香化氣片的氣相色譜指紋圖譜,確定了11個共有峰,并測定了其中3個組分的含量,結合化學模式識別評價20批樣品的質量。20批樣品的相似度均大于0.9,為了更客觀地反映沉香化氣片的內在質量,采用各指標成分的峰面積進行不同批次樣本的化學模式識別,可用于批次間的區分和歸類,主要將20批樣品分為2類,主成分分析結果能夠反映20種樣本的色譜圖直觀結果,找到了引起不同批次間質量差異的主要成分為D-檸檬烯、樟腦、乙酸龍腦酯、4,7-methanoazulene、α-布藜烯。以上結果表明氣相色譜指紋圖譜結合化學模式識別為沉香化氣片的質量控制提供簡單、可靠的方法。