計算機輔助一清片徑向展開薄層色譜定性與定量方法初探

田春杰, 陳明鑫, 王丹琦, 王宏玲, 關建環(huán), 張夢婷, 孫國祥

(沈陽藥科大學藥學院, 遼寧 沈陽 110016)

普通薄層色譜(thin layer chromatography, TLC)由于流動相的輸送方式和色譜系統(tǒng)的不均衡性,在分離能力、效率和重復性方面還存在一些不足。

徑向薄層色譜法(RTLC),是一種將樣品呈圓形或環(huán)狀點樣,然后將展開劑從中心向外沿徑向輸送的薄層色譜方法[1]。該法于1950年首次報道[2],常應用于多肽、氨基酸和重金屬的分離[3-5]。由于斑點的形態(tài)和展開方向的特殊性,目前用于分離的報道較多,對RTLC定性和定量的報道較少。

當前,普通TLC的定性方法主要有比移值(Rf)定性和相對比移值(Rr)定性法[6]。普通TLC定量的方法有目視比較法[7]、洗脫測定法[8-10]、斑點面積法[11]、薄層掃描法[12,13]和與其他技術的聯(lián)用方法[14-18]。其中薄層掃描法是目前使用最多的方法,也是較為可靠的技術手段之一。

薄層掃描法也稱薄層光密度法,一般采用透射法或反射法測定斑點對光的吸收強度[19]。這兩種方法測定的分別是斑點對照射光的吸收情況或反射情況。透射法對薄層厚度及透明度有一定的要求,但反射法對其要求不高,因此反射法較為常用。

圖像分析儀通常和計算機連接使用,依賴于計算機輔助圖像分析技術,是將圖像信號轉換為數(shù)字信號并使用計算機對其進行處理的過程[20]。目前,計算機數(shù)字圖像描述、特征提取和模式識別在醫(yī)學領域得到了廣泛的應用[21-24]。

一清片(YQTs)由黃連、大黃、黃芩3味藥組成,其功效為清熱瀉火解毒和化瘀涼血止血,臨床上用于火毒血熱所致的大便秘結、咽炎、扁桃體炎、牙齦炎等的治療[25-27]。在280 nm下,黃芩中的黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素均顯暗綠色;在335 nm下,野黃芩苷顯暗綠色[28,29]。在254 nm下,黃連中的巴馬汀和藥根堿顯黃綠色;在365 nm下,藥根堿顯棕褐色,小檗堿和巴馬汀顯黃色熒光[30-32]。大黃在365 nm下出現(xiàn)5個熒光斑點,均顯橘黃色,分別為蘆薈大黃素、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚和大黃酸,通過氨蒸汽熏蒸會呈現(xiàn)橙色斑點[33,34]。由于酸堿度、時間、顯色劑等均能導致藥材中有效成分的熒光淬滅[35-37],所以實驗需控制好酸堿度、時間長短以及避開能導致熒光淬滅的顯色劑。

本探究旨在通過薄層色譜光密度反射法結合自編程的計算機圖像識別技術,輔助實現(xiàn)一清片徑向展開薄層色譜技術定性和定量方法的開發(fā)與應用。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與分析軟件

ZF-C型3用紫外分析儀(上海康禾光電儀器有限公司);超聲波清洗機(廣州市吉普超聲波電子設備有限公司); ISO 9001電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

10批YQTs(遼寧康博士制藥有限公司);鹽酸小檗堿(BH)化學對照品(批號:0713-9605,供含量測定用)、鹽酸藥根堿(JH)化學對照品(批號:0733-9605,供含量測定用)和鹽酸巴馬汀(PH)化學對照品(批號:0732-9604,供鑒別用)(中國藥品生物制品檢定所)。硅膠板(型號:HSGF254, 3色分開,煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司);正丁醇(分析純,天津市富宇精細化工有限公司);乙酸乙酯(分析純,天津市富宇精細化工有限公司),冰乙酸(分析純,天津恒興化學試劑股份有限公司),無水乙醇(分析純,天津大茂化學試劑股份有限公司)。

軟件:Matlab 9.7, Origin 8.5, Photoshop CS 5。

1.2 溶液配制與展開溶劑系統(tǒng)

YQTs提取物:取1片YQTs,研細,取約0.3 g,精密稱定,加入10 mL 90% (體積分數(shù),下同)乙醇,超聲30 min,過濾,取濾液,即得。

稱取適量的BH、JH和PH對照品,分別用甲醇配制成0.16 g/L的溶液。

選用正丁醇-乙酸乙酯-冰醋酸-水(7∶1∶1∶1, v/v/v/v)作為溶劑系統(tǒng),分離文中的BH、JH、PH對照品和YQTs提取物。

圖 1 徑向展開(a)裝置和(b)展開方式示意圖[38]Fig. 1 Schematic diagram of (a) radial expansion device and (b) expansion mode[38]

1.3 徑向展開裝置

使用針頭、橡膠塞、玻璃管等自組裝簡單的RTLC裝置(見圖1a)。在展開過程中,在中心處安裝一個帶孔的蓋子,可以幫助減少環(huán)境因素的影響。具體的測試條件可以根據(jù)實際測試靈活變動。圖1b是RTLC的示意圖。試驗過程中,用環(huán)狀工具點出A處所指的環(huán)形斑點,或者用毛細管點出徑向斑點,用輸送工具從圓心O處向固定相上輸送展開劑,展開劑沿B處箭頭所示各個方向由中心向外展開,洗脫分離組分。

圖 2 徑向薄層色譜定性和定量方法流程圖Fig. 2 Flow chart of qualitative and quantitative methods for radial thin layer chromatography

1.4 計算機輔助一清片徑向展開薄層色譜定性與定量方法的建立

使用相機在紫外燈下采集數(shù)字圖像后,對圖像進行了一系列處理,具體操作流程見圖2。采用Photoshop CS 5對圖片進行方形裁剪(尺寸可調,一般4 cm×4 cm),調整圖片分辨率(數(shù)值可調,一般800 DPI)。將調整好的圖片導入到Origin 8.5中,將數(shù)字圖片轉換為數(shù)字矩陣,矩陣橫縱坐標對應的是原圖片每個像素點的位置,數(shù)值對應原圖片上各個像素點的灰度值(范圍0～255)。將數(shù)字矩陣導入到Matlab 9.7中,進行灰度值積分:以矩陣中心為原點,以1個像素點長度為步長,設定偏移量為±0.5個像素點,對在同一步長范圍的各個像素點的灰度值進行積分處理(步長和灰度值可調)。數(shù)據(jù)擬合:以半徑為橫坐標,各半徑對應的灰度值積分為縱坐標,繪制擬合曲線,進行預評價,尋找溶劑前沿對應的半徑值,并通過橫坐標的縮放變換,將溶劑前沿數(shù)值固定(數(shù)值可調,設為1最佳,此時橫坐標即為比移值),即可得到RTLC數(shù)字化圖譜,將數(shù)據(jù)文件導出。數(shù)字化圖譜后續(xù)的峰積分及其他特征參數(shù)提取在Origin軟件上完成。

上述的RTLC數(shù)字化圖譜中各峰頂點的橫坐標即代表各組分的比移值,可直接用于定性。各峰面積經過定量方法學驗證合格后,即可以用于一清片中組分的含量測定。

2 結果與討論

2.1 專屬性

將YQTs提取物和BH、JH、PH對照品各點樣3 μL,按照1.2、1.3節(jié)中方法展開后,照1.4節(jié)中方法進行數(shù)據(jù)處理。可確定峰1為JH,比移值0.27；峰2為PH,比移值0.38；峰3為BH,比移值0.47；樣品中組分比移值與對照品中該成分差異在±0.04以內(見圖3)。結果表明,方法的專屬性良好,可用于RTLC定性。

圖 3 數(shù)字化后的RTLC(a)數(shù)字圖像和(b)數(shù)字色譜圖Fig. 3 (a) Digital image and (b) digital chromatograms of RTLC after digitization Peaks: 1. jateorhizine (JH); 2. palmatine hydrochloride (PH); 3. berberine hydrochloride (BH).

2.2 定量方法及其驗證

2.2.1精密度

同一份YQT樣品,連續(xù)點樣6次,每次3 μL,展開后數(shù)據(jù)處理,以BH斑點面積計算RSD。RSD值為5.47%,本方法精密度可滿足薄層色譜技術要求。

2.2.2回收率

配制7份樣品,其中6份加入160 μg/mL的BH對照品溶液,混合均勻后,作為加樣待測液。一份與純甲醇按1∶1(v/v)混合,作為陰性液。每份樣品分別點樣2次,每次3 μL,展開后數(shù)據(jù)處理,根據(jù)外標一點法計算BH的回收率范圍及其RSD。其回收率范圍為92.5%～102.9%, RSD為4.08%。表明該方法的準確度符合薄層色譜技術要求,可用于RTLC定量。

表 1 RTLC法測定YQTs中BH的定性和定量結果Table 1 Qualitative and quantitative results of BH in YQTs determined by RTLC

Rf: retardation factor; ES: external standard.

2.3 對照品線性

分別精密吸取對照品溶液(160 mg/L) 2、4、6、8和10 μL進行展開,記錄色譜圖。分別以BH對照品質量(X, ng)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線圖。BH的線性回歸方程為:Y=0.123 8X+14.204(相關系數(shù)r=0.944 6)。結果表明:BH在60.5～960 ng范圍內時,可以使用峰面積來對YQTs中的BH進行含量測定。

2.4 樣品測定

10批YQTs樣品和外標樣品(ES, 160 mg/L)分別點樣2次,每次3 μL,展開后數(shù)據(jù)處理,記錄色譜圖。計算比移值進行定性,根據(jù)外標一點法計算YQTs中BH的含量,結果見表1。10批YQTs中,小檗堿的含量范圍在2.38～3.65 mg/片之間,質量差異較小。

2.5 計算機輔助RTLC定性與定量方法討論

在計算機輔助RTLC定性與定量方法中,有一些技術要點:(1)圖片裁剪為方形,只是為了矩陣計算方便,將一個完整的展開裁入即可,并沒有其他嚴格要求。對圖片進行固定大小的裁剪并調整分辨率是為了校正不同拍攝角度和不同拍攝距離導致的誤差。(2)分辨率、步長設置可以決定最后數(shù)字化的精度,與檢測器的數(shù)字采集密度是對應的。分辨率高,步長小,則數(shù)據(jù)采集密度大。數(shù)據(jù)采集密度理論上越大越好,這樣可以保證采集信息的完整性和豐富度。但是實際上不宜過高,因為采集過多的數(shù)據(jù)會給計算機的存儲和運算帶來負擔,降低運算速度,同時可能增大噪聲。本研究中,設定的圖片大小為4 cm×4 cm,分辨率為800 DPI,整張圖片的數(shù)據(jù)量為1 260×1 260個,使用的計算機為全新自組裝臺式機(CPU: Intel Core i5-8400 CPU@2.80GHz;主板:華碩PRIME Z370-P;內存:威剛8.00 GB (2400 MHz);主硬盤:250 GB (西數(shù)WDC WDS250G2 B0A-00SM50))。在計算機存儲和運行性能良好的情況下,運算時間大約為2分鐘。一般筆記本基本無法運行,強行運行速度緩慢甚至導致電腦死機或藍屏。(3)矩陣中心要盡可能準,這樣才能盡量保證數(shù)字化的真實性和準確性。(4)坐標變換時,溶劑前沿的固定數(shù)值是可調的,但在同一個實驗或進行同一批分析時應保證所有圖像處理時設定的溶劑前沿是相同的。這樣可以避免因分辨率、步長設置、圖像采集時相機與板間距離不固定,以及圖片裁剪大小不一致等造成數(shù)據(jù)失真和處理困難,同時相當于固定量綱,便于定性和定量計算。(5)不提前進行降噪等處理,既簡化了運算過程,也盡可能保證了數(shù)據(jù)的原始性。(6)因圖片采集、背景差異等造成的誤差全部可以通過合理的背景扣除消除,而不影響定性和定量的準確性。(7)灰度值積分是指以矩陣中心為原點,以半徑為橫坐標,對與原點距離相同的所有像素點的灰度值進行積分,這個過程類似于收折扇,為下一步的徑向展開數(shù)字化圖譜的生成提供數(shù)據(jù)基礎;由于像素點是一個個點,是非連續(xù)的數(shù)據(jù),而半徑是連續(xù)數(shù)據(jù),所以只能采用步長加偏移量的方式將在一定距離范圍內的像素點全部納入其中,既不重復統(tǒng)計像素點,又不遺漏有效數(shù)據(jù)點。例如,當半徑是2.5時,偏移量±0.5的意思是,將半徑距離在2.0～3.0內的像素點灰度值最終統(tǒng)計為一個數(shù)值。偏移量設置要與步長匹配,保證各像素點數(shù)據(jù)既不會被重復采集,又不會被遺漏。(8)經數(shù)字化處理后,徑向展開的斑點擴散、展開不均勻等問題會在峰寬和分離度上有所體現(xiàn),噪點會被均化,其實相當于自動去噪。(9)本文在進行圖片處理時,沒有進行由彩色圖片到灰色圖片的灰度轉換,每一個像素點都有像素坐標和像素亮度這兩個基本組成要素。一般圖片的像素坐標特征采用矩陣表示,彩色圖片的亮度值可以采用RGB色彩模式或灰度值表示,灰度圖像的亮度值則只能用灰度值進行表示。彩色圖像的灰度值與RGB色彩模式之間存在轉換公式:Gray=0.30Red+0.59Green+0.11Blue。Gray指灰度值,Red、Green、Blue是RGB色彩模式中紅、綠、藍3個通道的顏色。本文進行轉換的目的是簡化處理,方便積分。當然也可以對Red、Green、Blue單獨進行灰度值積分,結果是否會具有更好的特征性值得進一步探究。

3 結論

本文所采用的方法用于RTLC定性可靠度較好,在RTLC定量方面尚有欠缺,這可能與實驗環(huán)境條件等有關。實驗儀器簡陋,手動操作誤差大,數(shù)據(jù)采集時環(huán)境干擾大,都對實驗結果造成了嚴重影響。在本探究中,RTLC技術有很強的分離效率和潛在的半制備價值,使用適當?shù)膬x器設備有望發(fā)揮RTLC的技術優(yōu)勢。計算機圖像處理和自編程方法的結合,給了RTLC和其他一些分析相關的技術廣闊的發(fā)展前景。薄層色譜技術的發(fā)展很難、很慢,但是這項技術的優(yōu)勢也是無可替代的。相信在未來,在計算機技術的輔助下,薄層色譜技術會邁上一個新的臺階。