在線富集與高效液相色譜-熒光檢測法聯用同時檢測兒童水杯中9種雙酚類物質

韓疏影, 宋易霖, 康 安, 鄧海山, 朱 棟, 池玉梅

(南京中醫藥大學藥學院, 江蘇 南京 210023)

雙酚A(BPA)是生產聚碳酸酯塑料和環氧樹脂的中間體[1],早期被廣泛用于制作塑料水杯、餐具、嬰兒奶嘴、飲料及奶粉罐的內襯。研究表明,雙酚A是一種內分泌干擾物質,會從食品塑料包裝材料遷移到食品中,并被人體吸收[2]。因此,加拿大、歐盟和美國已禁止在嬰兒水杯中使用BPA[3]。隨后,一系列雙酚類物質(BPs)出現并應用于塑料工業,如雙酚B(BPB)、四甲基雙酚A(TMBPA)、雙酚C(BPC)、雙酚P(BPP)、雙酚Z(BPZ)、雙酚芴(BPFL)、雙酚AF(BPAF)和雙酚AP(BPAP)等[4-7]。該類物質的結構和性質與雙酚A類似,具有慢性毒性、基因毒性及雌激素樣活性[8,9]，但目前對其研究甚少[10,11]。迄今尚未見同時檢測以上9種雙酚類物質的相關報道。

國家標準GB/T 5009.156-2016規定,通過浸出實驗可實現水杯中雙酚類物質的檢測。使用大體積模擬樣品對雙酚類物質浸出后,需進行富集濃縮才可進行后續分析。用于BPs富集的傳統前處理方法主要有液液萃取法[12]和固相萃取法[13],但這些方法有機溶劑消耗量大,易造成環境污染。隨后,一些微萃取技術,如固相微萃取[14]、分散液液微萃取[15]和超分子溶劑微萃取[16-18]被用于檢測雙酚A,以實現儀器微型化和實驗綠色化。但這些實驗器材多為塑料材質,其中含有的雙酚類物質會嚴重干擾低濃度水平下雙酚類物質檢測的準確性[19]。高度自動化的在線富集前處理技術,可將樣品富集后直接分離檢測,可簡化實驗步驟,縮短分析周期;避免樣品污染,減少實驗誤差;降低樣品損失,提高分析靈敏度。

本文以塑料兒童水杯浸出液中可能含有的9種雙酚類物質作為分析對象,建立了自動在線富集與高效液相色譜-熒光檢測(online enrichment-HPLC-FLD)的方法,以簡化復雜的樣品前處理流程,如水體富集和凈化步驟,且使用熒光檢測器即可獲得與質譜法檢測相近的靈敏度[20],使水體中新型BPs的實時監測成為可能。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Thermo Fisher Ultimate TM3000高效液相色譜儀,配有DGP-3600RS雙三元泵、帶六通閥的TCC-3000柱溫箱、FLD-3400RS熒光檢測器和Chromeleon 7.10工作站(賽默飛世爾科技有限公司,美國); KH-700DE型數控超聲波清洗器(禾創超聲儀器有限公司,中國); MS-105DU電子分析天平(梅特勒托利多,瑞士)。

BPA(純度>99%)、BPZ(純度>98%)、BPFL(純度>98%)、BPAP(純度>99%)購自上海麥克林生物化學試劑有限公司;BPB(純度>95%)購自美國Ark Pharm公司;BPAF(純度>99%)購自北京百靈威科技;BPP(純度>98%)和BPC(純度>98%)購自日本Tokyo Chemical Industry公司;TMBPA(純度>98%)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。甲醇購自德國默克公司(達姆施塔特);娃哈哈純凈水購自杭州娃哈哈集團。

1.2 標準溶液配制

精密稱定9種雙酚類物質各0.01 g,分別置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容,得1 g/L各對照品儲備液;分別準確量取各對照品儲備液適量,置于50 mL容量瓶中,用5%(v/v)甲醇水溶液定容,得混合對照品儲備液(BHFL為0.1 g/L, BPA和BPB為0.1 mg/L,其他物質均為1.0 mg/L)。各對照品儲備液和混合對照品儲備液均在4 ℃下儲存。

移取混合對照品儲備液，逐級稀釋,得BPA和BPB質量濃度為0.4、2.0、4.0、10.0、20.0、40.0和80.0 ng/L, BPFL質量濃度為0.2、0.4、2.0、4.0、10.0、20.0、40.0和80.0 μg/L,其他雙酚類物質的質量濃度為2.0、4.0、20.0、40.0、100.0、200.0、400.0和800.0 ng/L的系列工作溶液，現用現配。

以不含BPs的去離子水作為空白溶劑配制實驗用溶液,且實驗過程中均使用玻璃器皿,以避免BPs從塑料實驗器皿中浸出,影響檢測結果的準確度[20]。

1.3 樣品前處理

購買10個聚碳酸酯兒童水杯,分別標注為1～10號,于25 ℃烘箱中干燥至恒重(每隔3 h稱重一次,以連續兩次干燥的重量差異在各水杯質量的萬分之三以內為恒重),測定水杯的高度(測定高度的上緣至水杯上邊緣的距離不超過1 cm)和平均直徑,估算其接觸面積。根據GB/T 5009.156-2016規定,按接觸面積以1.5 mL/cm2取相應體積的100 ℃熱水傾入杯中,蓋上表面皿,置于100 ℃烘箱中恒溫4 h,避光冷卻至室溫后即為水杯浸出液。

取5 mL浸出液進樣分析,以各物質的保留時間(tR)作為檢定物質的依據,tR偏差在2.5%范圍內可視為同一物質,并根據標準曲線計算各水杯浸出液中雙酚類物質的含量。剩余溶液轉移至玻璃錐形瓶中,儲存于4 ℃冰箱中,當水樣中雙酚類物質含量超出線性范圍時,取剩余浸出液稀釋至符合線性范圍,再進樣分析。

1.4 在線富集分析與高效液相色譜-熒光檢測條件

在線富集分析系統示意圖見圖1,六通閥切換條件為0～7.0 min時,六通閥為1-6位; 7.0～9.8 min時,六通閥切換至5-6位; 9.8～24.0 min時,六通閥切換回1-6位。

高效液相色譜-熒光檢測條件:分析柱為Sunfire C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,沃特世科技有限公司,美國);富集柱為Kromosil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm,漢邦科技有限公司,中國);柱溫為30 ℃;流動相為(A)甲醇和(B)水;流速為0.9 mL/min;進樣量為5 mL。采用的熒光激發波長與發射波長(λEx/λEm)為BPFL 230/319 nm, PA、BPB、BPAF、BPAP、BPC、BPZ、BPP和TMBPA 228/306 nm。梯度洗脫程序見表1。

圖 1 在線富集分析系統示意圖Fig. 1 Schematic diagrams of online enrichment and analysis system

表 1 梯度洗脫程序Table 1 Program of gradient elution

表 2 9種雙酚類物質的最佳激發波長與發射波長Table 2 Optimal excitation (λEx) and emission (λEm) wavelengths of the nine bisphenols

2 結果與討論

2.1 色譜條件的建立

2.1.1熒光波長的選擇

9種雙酚類物質的最佳激發波長與發射波長(λEx/λEm)見表2。若設定9個最佳λEx/λEm同時采集,則基線噪音增大,導致各物質的檢測靈敏度降低。如表2所示,9種物質的最佳λEx/λEm相近,故選用9種雙酚類物質的平均λEx/λEm采集熒光信號。結果表明,BPFL在此條件下響應信號強度明顯降低。因此,設置BPFL的最佳λEx/λEm(230/319 nm)采集其熒光信號,而對BPA、BPB、BPAF、BPAP、BPC、BPZ、BPP和TMBPA則采用平均λEx/λEm(228/306 nm)采集其熒光信號。

2.1.2洗脫與分離條件的優化

參照文獻[21],本實驗首先固定富集流動相為甲醇-水(5∶95, v/v),富集時間為5 min。在此條件下進行洗脫與分離條件的優化。為減小峰展寬,縮短分析時間,同時避免富集柱上的強保留雜質被洗脫至分析柱上,在保證所有目標物完全轉移至分析柱的前提下,反沖時間應盡可能短。設Vf=tf×F、Vc=π×r2×L,其中，Vf和Vc分別為反沖體積和富集柱體積(mL)、tf為反沖時間(min)、F為流動相體積流速(mL/min)、r為色譜柱內徑(cm),L為色譜柱長(cm)。當Vf≥Vc時,可使目標物轉移至分析柱;當Vf=Vc時,得最短反沖時間為2.8 min。

實驗考察了乙腈-水和甲醇-水體系對9種雙酚類物質的洗脫和分離能力,并優化洗脫和分離的流動相條件。結果表明,當洗脫流動相為甲醇-水,且以表1中右泵梯度程序洗脫時,各目標分析物可實現基線分離。

圖 2 不同富集時間對雙酚類物質富集效率的影響(n=3)Fig. 2 Effect of enrichment time on the enrichment efficiencies of the nine bisphenols (n=3)

2.1.3富集條件的優化

實驗同樣對富集過程中的富集流動相比例以及富集時間進行了優化。考慮本實驗需除去水溶性雜質,保留疏水性較高(lgKow>3.295[22])的雙酚類物質,因此以甲醇-水(5∶95, v/v)作為富集流動相,以0.9 mL/min的流速將樣品帶入在線富集柱,淋洗雜質并富集待測物,以減少待測組分的損失,提高結果的準確度。同時,采用與富集流動相組成相同的5%(v/v)甲醇水溶液溶解樣品,以減少大體積進樣(5 mL)產生的溶劑效應對富集效果的影響。

實驗對富集時間進行了優化(見圖2)。結果表明,在2～7 min時,富集效率隨著富集時間增加而增加;7 min后,BPAP、BPC、BPFL及BPP的富集效率隨富集時間的增加而減小,可能原因是這些雙酚類物質疏水性相對較弱,用高水相比例的富集流動相長時間淋洗后,導致部分樣品被洗脫;當富集時間增至8.3 min時,TMBPA在HPLC系統內的保留時間大大增加(>25 min),使分析周期延長,降低分析效率。因此,實驗選擇7 min作為富集時間。

以優化后的富集、洗脫和分離條件對9種雙酚類物質進行在線富集分析檢測,結果見圖3,各物質間均達到基線分離,在激發/發射波長為228/306 nm和230/319 nm時，基質中的雜質對分析結果均無影響,分離效果良好。

圖 3 空白對照品溶液、混合對照品溶液和7號水杯 浸出液在不同檢測波長下的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of the blank standard solution, mixed standard solutions and extracted solution of bottle No. 7 Mass concentrations: 40 ng/L for BPA and BPB; 400 ng/L for BPAF, BPAP, BPC, BPZ, BPP and TMBPA; 40 μg/L for BPFL. Peak identifications: 0. unknown impurity; 1. BPA; 2. BPB; 3. BPAF; 4. BPAP; 5. BPC; 6. BPFL; 7. BPZ; 8. BPP; 9. TMBPA.

2.2 方法學考察

按歐盟非強制執行法案2002/657/EC,考察所建分析方法的專屬性、線性范圍、準確度、精密度、穩定性、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。

2.2.1專屬性

在建立的色譜條件下,各物質的分離度為1.20～4.46,雜質峰與待測物質峰間亦可達基線分離(1.77～2.04),說明該方法專屬性良好。

2.2.2線性范圍、檢出限和定量限

取每日配制的標準工作溶液,以各待測物的色譜峰面積對質量濃度繪制標準曲線,線性回歸方程和相關系數(r2)見表3。9種雙酚類物質在各自范圍內均呈良好的線性關系,相關系數均大于0.998,符合含量測定要求。以3倍和10倍信噪比(S/N)對應的雙酚類物質的質量濃度作為方法檢出限和定量限,得各雙酚類物質的LOD與LOQ見表3。

表 3 9種雙酚類物質的回歸方程、線性范圍、相關系數、檢出限和定量限Table 3 Regression equations, linear ranges, correlation coefficients (r2), LODs and LOQs of the nine bisphenols

Y: peak area;X: mass concentration, ng/L.

表 4 9種雙酚類物質的日間、日內精密度、加標回收率和相對標準偏差(n=6)Table 4 Intra-day precisions, inter-day precisions, spiked recoveries and relative standard deviations of the nine bisphenols (n=6)

Low, medium and high levels: 2, 20 and 40 ng/L for BPA and BPB; 2, 20 and 40 μg/L for BPFL; 20, 200, 400 ng/L for BPAF, BPAP, BPC, BPZ, BPP and TMBPA.

2.2.3精密度與準確度

分別移取2、20、40 ng/L BPA和BPB, 2、20、40 μg/L BPFL及20、200、400 ng/L BPAF、BPAP、BPC、BPZ、BPP和TMBPA低、中、高3個水平的樣品3份,于3 d內每天進樣6針,以峰面積的值計算相對標準偏差(n=6),考察日內及日間精密度(見表4)。結果表明,日內精密度為0.4%～9.6%;日間精密度為0.5%～10.2%。

取上述低、中、高3份樣品各5 mL,向其中分別加入0.5、1.0和2.0倍水平的標準工作溶液5 mL,每個加標水平樣品平行6份,分別測定并計算回收率和相對標準偏差,結果見表4。9種雙酚類物質的加標回收率為90.7%～112.4%, RSD為0.9～11.3%,表明該方法的精密度和準確度均符合含量測定要求。

2.2.4穩定性

將新鮮配制的中等水平對照品溶液分成兩份,分別于4 ℃和25 ℃條件下儲存,自配制時刻起于0、12、24、48和72 h進樣測定,計算峰面積的RSD,并用12、24、48和72 h時物質的峰面積與0 h時的峰面積(計為100%)比較,以表征物質的降解趨勢(見圖4)。在低溫條件下(4 ℃), 72 h內9種雙酚類物質峰面積的RSD為0.4%～10.4%,表明這9種物質在低溫狀態下性質穩定;而當溫度升至25 ℃時,BPA、BPB、BPAF、BPAP、BPC、BPFL、BPZ和TMBPA的峰面積于72 h后明顯降低(>10%),說明常溫下9種雙酚類物質的穩定性降低。因此,所有工作溶液需當天配制使用,并于4 ℃冰箱內儲存。

圖 4 25 ℃下9種雙酚類物質在72 h內的降解趨勢圖(n=3)Fig. 4 Degradation trends of the nine bisphenols in 72 h at 25 ℃ (n=3)

表 5 市售兒童水杯中9種雙酚類物質的檢出量Table 5 Contents of the nine bisphenols in children’s water bottles from markets mg/kg

+ the content was under LOQ; / the content was not detected.

2.3 兒童水杯浸出液中9種雙酚類物質的檢測

2.3.1含量測定

采用所建方法檢測兒童水杯浸出液中9種雙酚類物質的含量(見表5)。計算公式為雙酚含量=n×c×Δm/(m0×ρ),其中,n為稀釋倍數,c為計算的待測物含量(ng/L),m0為兒童水杯的質量(g), Δm為浸出液的質量(g),ρ為水的密度(g/cm3)。結果表明,90%的水杯有較高含量的BPA(>0.6 mg/kg,歐盟條例2004/19/EC規定,雙酚A的遷移量不得超過0.6 mg/kg); BPB、BPC、BPAF和TMBPA等雙酚類物質的檢出率分別為30%、50%、30%和20%(檢出量>LOQ的水杯數占總水杯數的比例),其檢出量遠低于BPA的檢出量,表明目前塑料兒童水杯中的雙酚類化合物仍以BPA為主。因此本文所建方法不僅可以有效監測水樣中多種雙酚類物質,也可用以評估和監控BPA替代品的使用趨勢。此外,由于BPFL的熒光吸收較弱,本法對BPFL的檢測靈敏度(LOQ為200 ng/L)低于其他8種物質,在本文中未有檢出,因此后續研究將結合更有效的前處理方法或分析方法，以進一步提高BPFL的檢測靈敏度。

2.3.2兒童水杯浸出液中雙酚類物質含量隨使用次數的變化

為模擬實際生活中兒童水杯循環使用的情況,按1.3節方法重復處理1號、7號、9號和10號水杯各5次,每次取100 ℃下恒溫4 h的浸出液分析,以峰面積與浸出液質量的比值表征單位質量浸出液中雙酚類物質的含量,考察兒童水杯的循環使用次數對其中雙酚類物質浸出量的影響(見圖5)。結果表明,各物質的浸出量整體呈先上升后下降的趨勢,在第2～4次處理時(在100 ℃條件下累計維持4～16 h),浸出量達到最高,在第5次處理時(在100 ℃條件下累計維持20 h),絕大多數雙酚類物質的浸出量約降為新水杯中雙酚類物質浸出量的1.0～1.5倍,表明新水杯使用數次后會釋放出大量雙酚類物質,隨著使用次數增加,水杯中雙酚類物質浸出量雖然下降,但仍會不斷釋放。隨著浸出時間增加,BPA浸出量下降趨勢最顯著,這可能與BPA在高溫時不穩定有關(見圖4);而BPC在1號、7號和9號水杯中的浸出量均基本不變,說明該物質在水杯使用過程中穩定而持續釋放,這與其在穩定性實驗中表現出的良好穩定性一致(見圖4, 25 ℃下72 h內基本不降解)。該結果表明,作為BPA替代物出現的各類BPs,如BPC、BPP和BPAF等,因其良好的化學穩定性,反而不易降解,更易隨水杯的使用持續不斷釋放并遷移。

圖 5 浸泡次數對水杯中雙酚類物質遷移量的影響Fig. 5 Effect of soaking times on the extracted amounts of bisphenols from water bottles Bottles: a. No. 1; b. No. 7; c. No. 9; d. No. 10.

3 結論

本文采用在線富集與高效液相色譜-熒光檢測聯用技術,建立了簡便、高效、準確測定水中9種雙酚類物質的方法。本方法優化了在線富集和分析過程,實現了樣品的在線富集和除雜,避免了繁瑣的樣品前處理過程,大大節約了實驗時間和成本,且重復性好,準確度高,適用于水中痕量雙酚類物質的檢測。將此法用于檢測我國市售兒童水杯的浸出液中9種雙酚類物質,發現作為BPA替代物出現的新型BPs,因穩定性較BPA高,不易降解,更易隨著水杯的使用持續不斷釋放并遷移,故使用本文所建方法同時快速監測這些雙酚類物質具有重要意義。