2型糖尿病血管病變患者TIPE2與TF的檢測及臨床意義

熊石龍，吳一行，龔芳，何偉

隨著人們生活水平的提高以及生活模式“西方化”、社會(huì)人口老齡化，我國糖尿病患病人數(shù)逐年增高。糖尿病是一種全身性代謝紊亂性疾病，不僅會(huì)影響糖類的代謝，導(dǎo)致高血糖、血糖波動(dòng)，還會(huì)影響蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝，導(dǎo)致脂代謝紊亂和高脂血癥，從而造成血管壁炎性損傷、狹窄。相關(guān)研究表明，炎癥和免疫反應(yīng)可能與2 型糖尿病（T2DM）及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1］。

組織因子（tissue factor，TF），又稱組織凝血活酶（Thromboplastin），在糖尿病患者中表達(dá)明顯增高，是血管內(nèi)皮損傷的重要標(biāo)志，也是外源性凝血途徑的啟動(dòng)因子和重要的炎癥因子［2］。新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子α 誘導(dǎo)蛋白8 樣分子2（tumor necrosis factor-α induced protein 8 like-2，TIPE2）屬于腫瘤壞死因子α 誘導(dǎo)蛋白8（tumor necrosis factor-α induced protein-8，TNFAIP8）家族，優(yōu)先表達(dá)在淋巴組織和炎癥組織中，是一種炎癥負(fù)性調(diào)節(jié)因子，在保持免疫平衡中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［3］。但免疫調(diào)節(jié)因子TIPE2與炎癥因子TF在T2DM血管病變患者中的作用及其關(guān)系尚不明確。本研究旨在探討T2DM 血管病變患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）中TIPE2與TF的變化，了解TIPE2、TF及腫瘤壞死因子（TNF）-α 對T2DM 血管病變患者的臨床意義，為進(jìn)一步對T2DM 血管并發(fā)癥的臨床有效干預(yù)提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院番禺院區(qū)2015年5月—2016年5月收集的T2DM患者78例，其中男54例，女24例。所有患者診斷均符合2013版中國T2DM防治指南中的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。患者依據(jù)是否合并有血管病變，分為血管病變（T2DM+V）組36 例和非血管病變組（T2DM）組42 例，T2DM+V 組患者均合并微血管及大血管病變，T2DM 組均未合并微血管及大血管病變。排除1型糖尿病（T1DM）及繼發(fā)性糖尿病者；患急性感染性疾病者；合并高血壓腎病、慢性腎小球腎炎、尿毒癥或透析患者；合并風(fēng)濕性疾病或其他內(nèi)分泌代謝疾病者；合并心腦血管疾病、肝腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病、腫瘤、感染者；長期服用避孕藥者；妊娠、哺乳期女性。另選取同期在我院體檢正常者40例為對照（CON）組，均排除糖尿病及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，空腹糖耐量正常，無感染、心、肝、肺、腎等疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)論證通過，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器 糖化血紅蛋白（HbA1c）分析儀（東曹上海生物科技有限公司，HLC-723G8），貝克曼全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司，DXC600），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，7500fast），酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司，Synergy HT）。HbA1c檢測試劑盒購自廣州惠堯生物科技有限公司；總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）檢測試劑盒均購自德國德賽診斷系統(tǒng)有限公司；Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液購自美國GE 醫(yī)療集團(tuán)；Trizol 試劑及RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國Invitrogen 公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。引物購自上海吉?jiǎng)P生物技術(shù)有限責(zé)任公司。血漿TF 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒購自美國ADI公司，血漿TNF-α ELISA試劑盒購自美國R & D公司。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料收集 收集并記錄研究對象年齡、性別、血清HbA1c、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。高效液相色譜法檢測HbA1c；酶比色法檢測TC 和TG；修飾酶法檢測HDL-C 和LDL-C。

1.3.2 PBMCs 分離 清晨采集空腹血樣3 mL，加入Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液，密度梯度離心法進(jìn)行分離，取中間白膜層，即PBMCs。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測PBMCs中TIPE2、TF mRNA表達(dá) 利用Trizol 試劑從新鮮的PBMCs 中提取總RNA，一步法逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 后使用SYBR Green 染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，按照說明書步驟檢測TIPE2、TF 的mRNA 表達(dá)。引物序列：TIPE2，上游5′-TGTGCTGCTAGAGTTGGTGGA-3′，下游5′-TGCCAAGGTGCTGAGTGAA-3′；TF，上游5′-CCCAAACCCGTCAATCAAGTC-3′，下游5′-CCAAGTACGTCTGCTTCACAT-3′ ；β - actin，上游 5′- GGTGGTCTACCCTTGGACCC-3′ ，下 游 5′- GATACTTGTGGGCCAGGGCA-3′。兩步法PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃30 s；95 ℃3 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。總反應(yīng)體積20 μL。根據(jù)qPCR 得出的熒光曲線Ct 值，以β-actin 為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法統(tǒng)計(jì)結(jié)果，ΔCt＝目的基因Ct 值-內(nèi)參Ct 值，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組ΔCt 值-對照組ΔCt值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 ELISA 檢測血漿TF和TNF-α水平 采集清晨空腹外周血，靜置30 min 后，3 000 r/min 離心10 min，將血漿分裝凍存于-80 ℃冰箱備用，集中測量。嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行檢測，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品光密度（OD）值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TF及TNF-α濃度，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料應(yīng)用例（%）表示，多組之間比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，指標(biāo)間關(guān)系測定采用Pearson線性相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組一般臨床資料比較 3組性別、年齡、血脂方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與CON 組相比，T2DM 組和T2DM+V 組HbA1c 升高，且T2DM+V組高于T2DM組（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of general clinical data between three groups表1 3組一般臨床資料比較

2.2 3組PBMCs 中TIPE2、TF mRNA 表達(dá)情況 與CON 組比較，T2DM 組TIPE2 mRNA 表達(dá)水平降低，T2DM+V 組較T2DM 組更低（均P＜0.05）。T2DM 組TF mRNA 表達(dá)水平高于CON 組，T2DM+V 組高于T2DM組（均P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of TIPE2 mRNA and TF mRNA of PBMCs between three groups表2 3組PBMCs中TIPE2、TF mRNA表達(dá)水平的比較（±s）

Tab.2 Comparison of TIPE2 mRNA and TF mRNA of PBMCs between three groups表2 3組PBMCs中TIPE2、TF mRNA表達(dá)水平的比較（±s）

＊＊P＜0.01；a與CON組比較，b與T2DM組比較，P＜0.05

組別CON組T2DM組T2DM+V組F n 40 42 36 TIPE2 mRNA 1.04±0.06 0.33±0.07a 0.13±0.04ab 2 364.317＊＊TF mRNA 1.04±0.06 3.42±0.47a 5.85±0.78ab 820.459＊＊

2.3 3組血漿中TF、TNF-α濃度比較 與CON組相比，T2DM 組TF、TNF-α 濃度明顯升高，T2DM+V 組較T2DM 組TF、TNF-α 濃度升高更明顯（均P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of plasma levels of TF and TNF-α between three groups表3 3組血漿中TF、TNF-α濃度的比較 （ng/L，±s）

Tab.3 Comparison of plasma levels of TF and TNF-α between three groups表3 3組血漿中TF、TNF-α濃度的比較 （ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與CON組比較，b與T2DM組比較，P＜0.05

組別nTFTNF-α CON組T2DM組T2DM+V組F 40 42 36 21.63±2.66 32.21±2.48a 38.39±3.89ab 299.337＊＊20.13±2.04 29.79±2.16a 39.27±4.96ab 329.118＊＊

2.4 3組間各指標(biāo)相關(guān)性分析 CON 組及T2DM 組內(nèi)各指標(biāo)間無相關(guān)性。T2DM+V 組PBMCs 中TF mRNA 與TIPE2 mRNA 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.340，P＜0.05），血漿TF與血漿TNF-α呈正相關(guān)（r=0.724，P＜0.001）。3組PBMCs 中TIPE2 mRNA 表達(dá)與TF mRNA 及血漿TF、TNF-α 濃度的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，T2DM+V 組中TIPE2 mRNA 表達(dá)水平與TF mRNA及血漿TNF-α均呈負(fù)相關(guān)，見表4。

Tab.4 Correlation between TIPE2 mRNA and TF mRNA,plasma levels of TF and TNF-α in three groups表4 3組TIPE2 mRNA表達(dá)水平與TF mRNA表達(dá)水平及血漿TF、TNF-α濃度的相關(guān)性分析（r）

3 討論

隨著胰島素、口服降糖藥物的廣泛應(yīng)用，高血糖及急性合并癥，如酮癥酸中毒導(dǎo)致的死亡人數(shù)己顯著下降，目前各種急慢性并發(fā)癥已成為嚴(yán)重影響糖尿病患者生存質(zhì)量的主要原因，其中糖尿病血管病變是最常見的也是患者致死、致殘的最主要的原因之一。T2DM 血管病變主要包括大血管病變和微血管病變，并發(fā)大血管病變多見于主動(dòng)脈、腦動(dòng)脈及冠狀動(dòng)脈，極易引起嚴(yán)重的心、腦血管意外；微血管病變主要表現(xiàn)為糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病變和糖尿病心肌病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［5］。

3.1 血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是糖尿病血管病變的根本原因 高血糖引起超氧化物生成增多，繼而引起氧化應(yīng)激及生成的糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）被公認(rèn)為是導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能損傷的兩個(gè)重要環(huán)節(jié)［6］，高血糖還可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥、凋亡，從而造成血管壁的結(jié)構(gòu)改變和血管內(nèi)皮功能損傷［7］。此外，T2DM患者體內(nèi)普遍存在微炎癥狀態(tài)。微炎癥狀態(tài)是指既非微生物感染，又不同于全身炎癥反應(yīng)綜合征的慢性、進(jìn)展性、低強(qiáng)度性、相對隱匿性的炎癥狀態(tài)，其特征是單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)激活，產(chǎn)生TNF-α和白細(xì)胞介素（IL）-6等炎癥因子，進(jìn)而參與T2DM 及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展［8］。TNF-α可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成酶（NOS）表達(dá)與活性，降低內(nèi)皮細(xì)胞胰島素受體表達(dá)及磷酸化，抑制胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性血管舒張功能受損，并促進(jìn)多種因子及細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，最終引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞功能異常甚至凋亡。本研究結(jié)果表明，T2DM+V 組血漿TF 和TNF-α 水平高于T2DM組和CON 組，相關(guān)性分析表明TF 與TNF-α 呈正相關(guān)，提示炎癥因子TF、TNF-α在T2DM血管病變的發(fā)生發(fā)展中起協(xié)同促進(jìn)作用。

3.2 血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷可誘導(dǎo)炎癥因子TF 表達(dá) 病理情況下，TF過度表達(dá)及活性異常升高將導(dǎo)致動(dòng)、靜脈血栓形成。在動(dòng)脈粥樣硬化過程中，粥樣斑塊中的巨噬細(xì)胞表達(dá)大量TF，高水平TF 暴露引發(fā)血栓形成和心肌梗死。除誘導(dǎo)生理性凝血和病理性血栓形成外，TF本身還可以作為一種炎癥因子參與炎癥反應(yīng)，抑制TF 表達(dá)可減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的凝血、炎癥反應(yīng)和小鼠的死亡率［9］。TF是損傷-炎癥-凝血網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵分子，在凝血與炎癥反應(yīng)中起重要作用［10］。因此，有效抑制TF 表達(dá)具有重要的臨床意義。

3.3 TIPE2是先天性免疫及獲得性免疫的負(fù)性調(diào)節(jié)者 TIPE2 通常表達(dá)在髓系和淋巴系的免疫細(xì)胞中，特別是在T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)以及維持免疫平衡的重要負(fù)性調(diào)節(jié)因子。TIPE2敲除的小鼠可出現(xiàn)慢性炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為體質(zhì)量下降、脾腫大、白細(xì)胞增高以及多器官自發(fā)性炎癥反應(yīng)，內(nèi)毒素刺激后則出現(xiàn)過度應(yīng)答以致發(fā)生膿毒癥，甚至死亡［3］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者PBMCs 中TIPE2 mRNA 表達(dá)水平較健康對照者明顯降低，且與SLE 患者的疾病活動(dòng)度評分呈負(fù)相關(guān)［11］。Ma等［12］研究發(fā)現(xiàn)，在哮喘患兒PBMCs 中TIPE2 mRNA 表達(dá)水平明顯下降。此外，慢性HBV感染肝炎患者PBMCs 中TIPE2的表達(dá)水平也明顯下降，且TIPE2 水平與血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）水平呈負(fù)相關(guān)［13］。本課題組前期研究也表明，增強(qiáng)臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞TIPE2 表達(dá)可有效下調(diào)TF 的表達(dá)［14］，但在PBMCs 中TIPE2 與TF 的關(guān)系鮮見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，T2DM+V 組患者PBMCs 中TIPE2表達(dá)下調(diào)，而TF表達(dá)上調(diào)，與單純T2DM組和CON 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；外周血中炎癥因子TF、TNF-α則高于其他2組，且T2DM+V 組TIPE2表達(dá)與TF mRNA、TNF-α呈負(fù)相關(guān)，提示TIPE2下調(diào)可活化下游信號(hào)傳導(dǎo)，合成釋放炎癥因子TF、TNF-α，觸發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重炎癥程度，惡化細(xì)胞生存環(huán)境，引發(fā)血管內(nèi)皮損傷、功能障礙和機(jī)體血糖進(jìn)一步升高，最終導(dǎo)致糖尿病血管病變的發(fā)生。

3.4 不足與展望 由于研究病例數(shù)較少，且具有一定地域特點(diǎn)，在一定程度上限制了研究結(jié)果的涵蓋性和代表性，下一步需要多中心協(xié)作、大樣本的臨床研究來進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，T2DM 患者PBMCs 中TIPE2 與TF 的表達(dá)密切相關(guān)，TIPE2、TF可能通過炎癥機(jī)制參與糖尿病血管病變的發(fā)生發(fā)展，有效提高TIPE2、抑制TF可為T2DM的分子治療提供新的思路。