等毒性劑量芥子氣不同途徑誘導大鼠急性肺損傷的氧化應激反應差異探討

胡曉璇，于丹，謝劍煒，許德鳳，鐘玉緒△

芥子氣（sulfur mustard，SM）是一種具有烷化和糜爛特性的化學毒物［1］。純SM黏稠無味，具有疏水性和較強的親脂性。SM 通常經眼睛、皮膚、呼吸道及胃腸道等上皮和黏膜屏障侵入機體，觸發全身不同器官的急性和遲發性毒性作用［2］。研究表明，SM可耗竭細胞內抗氧化劑如谷胱甘肽（glutathione，GSH）和硫氧還蛋白，導致線粒體膜改變，促使活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產生過剩［3］。與此同時，誘導抗氧化酶如超過氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathion peroxidase，GSH-Px)、硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase，TrxR）及谷胱甘肽-S-轉移酶（glutathione S-transferases，GST）活性喪失，由此引發肺的氧化應激反應［4］。SM誘導的炎癥和氧化應激機制相互關聯，互為因果，在肺損傷機制中起著關鍵的作用［5］。本研究在預實驗獲取SM 等毒性劑量（1LD50）基礎上，建立SM 經腹腔和氣管途徑誘導急性肺損傷大鼠模型，比較2 種模型血清抗氧化酶譜水平和肺泡間隔相關蛋白表達的差異性，并探討SM誘導急性肺損傷的分子機制，為其治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 SM（液態，純度96%）由中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院毒物藥物研究所提供。1，2-丙二醇溶液購自天津致遠化學有限公司。SOD、CAT、GSH-Px 酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）試劑盒購自杭州聯科生物技術有限公司。銅鋅超過氧化物歧化酶（CuZn-superoxide dismutase，CuZn-SOD）、錳超過氧化物歧化酶（Mn-superoxide dismutase，Mn-SOD）、對氧磷酶-1（paraoxonase-1，PON-1）、載脂蛋白-1（apolipoprotein-1，ApoA-1）免疫組化試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司。全自動生化免疫一體機COBAS 8000型（瑞士羅氏公司）；冷光源AXEL-300 型（德國歐司朗公司）；光學顯微鏡BX51型（日本奧林巴斯公司）；Image Pro Plus 6.0病理細胞圖像分析系統（美國Media Cybernetics公司）。

1.2 實驗動物與分組 SPF級健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院實驗動物中心，合格證號：11401500045809）226 只，體質量280～300 g，15周齡。隨機抽取50只SD大鼠行預實驗，經過霍恩氏法計算不同給藥途徑下的半數致死量（median lethal dose，LD50），依預實驗情況將正式實驗中給藥劑量調整為0.96 LD50=8 mg/kg（腹腔途徑）和0.98 LD50=2 mg/kg（氣管途徑），然后以1LD50的SM 染毒。將大鼠分為腹腔SM 組（40 只）、腹腔丙二醇組（32只）、氣管SM組（40只）、氣管丙二醇組（32只）、正常對照組（32 只）。腹腔SM 組和氣管SM 組各取40 只，目的是SM（1LD50）染毒后，排除大鼠死亡數，保證每組每時間段樣本量（n=8）。SM臨用前用丙二醇稀釋至所需濃度。

1.3 建模 （1）大鼠氣管途徑染毒模型建立：實驗前氣管SM組和氣管丙二醇組皮下注射阿托品（0.05 mg/kg），30 min后腹腔內注射鹽酸氯胺酮（100 mg/kg）實施麻醉，氣管內注入稀釋的SM 0.1 mL，氣管丙二醇組注入丙二醇0.1 mL。（2）大鼠腹腔途徑染毒模型建立：同氣管途徑方法實施麻醉。大鼠腹腔SM組腹腔內注入稀釋的SM 0.1 mL，腹腔丙二醇組注入丙二醇0.1 mL。正常對照組不做任何處理。分別在注射后6、24、48、72 h每組隨機選取8只動物抽取血樣和獲取組織標本。

1.4 ELISA 法檢測血清酶譜變化 將腹腔SM 組、腹腔丙二醇組、氣管SM 組、氣管丙二醇組、正常對照組不同時間點獲取的大鼠血2 mL，37 ℃水浴1 h，4 ℃過夜，然后223.6×g離心10 min，取上清液，分裝在無菌小瓶中，-80 ℃保存備用。采用全自動生化免疫一體機檢測血清SOD、CAT、GSH-Px 濃度。所有流程嚴格按說明書進行操作。

1.5 免疫組化（SP 法）染色CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1、ApoA-1 的表達 收集各組大鼠肺組織標本，石蠟包埋、切片、脫蠟、水化、枸櫞酸緩沖液抗原修復，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌，3%過氧化氫封閉，正常山羊血清封閉，滴加兔抗大鼠CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1、ApoA-1 單克隆抗體（20 μL/片），PBS 代替一抗作陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照，DAB 顯色，蘇木素復染，脫水，中性樹膠封片。每張切片隨機抽取5個不重復視野，計算其肺泡間隔陽性細胞數（包括陽性和強陽性），取平均值。陽性指細胞漿或核出現棕黃色顆粒，強陽性細胞指細胞漿或核出現棕褐色顆粒。

1.6 統計學方法 采用SPSS 23.0統計軟件對數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料采用±s表示，多組間比較用重復測量的多因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q法，其中各時點組間比較用多元方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SM（1LD50）不同給藥途徑對大鼠抗氧化酶譜的影響 1LD50采用的是芥子氣染毒后7 d內的數據，時間效應與干預措施間對各組各指標均有影響，且存在交互作用（P＜0.05）。（1）組間比較：在同一時間點，腹腔和氣管SM 組血清SOD、CAT、GSH-Px 水平與其他3組相比均升高（P＜0.05）；腹腔SM 組較氣管SM 組各指標水平亦升高（P＜0.05）。（2）組內比較：腹腔SM組和氣管SM組血清SOD、CAT、GSH-Px水平均24 h 達高峰，然后逐漸下降（P＜0.05），見表1、2。

2.2 SM（1LD50）不同給藥途徑對大鼠肺泡間隔CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1、ApoA1 蛋白表達的影響 腹腔SM 組和氣管SM 組6 h 肺泡間隔CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1、ApoA-1蛋白陽性表達呈帶狀分布，24 h聚集成簇，48 h和72 h呈團簇狀。腹腔和氣管丙二醇組、正常對照組呈零星分布，見圖1～4。

時間效應與干預措施間對各指標均有影響，且存在交互作用（P＜0.05）。（1）組間比較：在同一時間點，腹腔SM 組和氣管SM 組肺泡間隔CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1、ApoA-1蛋白陽性表達率與其他3組相比均升高（P＜0.05）；腹腔SM組較氣管SM組亦升高（P＜0.05）。（2）組內比較：隨時間延長，腹腔SM組肺泡間隔CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1、ApoA-1蛋白陽性表達率相均呈升高趨勢（P＜0.05）；氣管SM組肺泡間隔CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1、ApoA-1 蛋白陽性表達率均呈升高趨勢（P＜0.05），見表3、4。

3 討論

SM是一種親脂的和損傷細胞的烷化劑，可誘導血液、肝、肺組織細胞內抗氧化劑（GSH）和抗氧化酶減少，脂過氧化反應和氧化型GSH 增加，ROS 蓄積，導致脂類、蛋白、核酸損傷［6］。ROS可直接影響肺細胞凋亡與增殖、細胞外基質代謝、線粒體呼吸系統、表面活性物質維持及肺泡修復和免疫調節的重塑。一旦細胞內產生的ROS 增加，則會出現線粒體的損傷或功能不全，誘發細胞凋亡。氧化與抗氧化的平衡是機體維持正常細胞生理代謝的重要環節，一旦失衡即可轉為病理狀態。細胞的抗氧化系統包括抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px、GST）和抗氧化劑（GSH、維生素E、A、C）。SOD 能將過剩的超氧化物陰離子轉化為水；CAT 和GSH-Px 則將過氧化氫轉化為水［7］。研究顯示，SM誘導慢性肺損傷患者抗氧化酶和抗氧化劑明顯減少，說明機體內ROS 產生與細胞抗氧化防御系統之間處于嚴重的失調狀態［5］。本研究發現，暴露SM（1LD50）后，腹腔SM 組和氣管SM 組大鼠血清SOD、CAT、GSH-Px 水平逐漸升高，24 h 達高峰，然后呈遞減趨勢，呈一過性升高，且腹腔SM 組不同時間段的血清抗氧化酶譜的變化更為明顯，提示SM 無論經何種途徑染毒均可吸收入血，引起大鼠全身性氧化應激反應。本結果與Jafari等［7］報道的結果一致，分析可能與大鼠自身通過酶升高產生一種保護性作用來對抗SM 誘導急性肺損傷有關，這樣可能有利于肺泡和血液中產生足量的超氧化物陰離子來拮抗氧化應激反應。因此，筆者認為，短時間血清SOD、CAT、GSH-Px 水平的升高，可能是機體對氧化與抗氧化失衡的一種代償反應；出現逐漸遞減，提示這種代償反應屬于一過性。一旦出現抗氧化酶和抗氧化劑失代償，將會導致機體的SM 中毒反應。在相應的時間段補充外源性抗氧化酶和抗氧化劑治療，有可能成為阻止SM誘導肺損傷發展的關鍵環節之一［8］。

Tab.1 Changes of serum levels of SOD,CAT and GSH-Px levels in five groups of rats表1 各組大鼠血清SOD、CAT及GSH-Px水平變化（n=8，U/mL，±s）

Tab.1 Changes of serum levels of SOD,CAT and GSH-Px levels in five groups of rats表1 各組大鼠血清SOD、CAT及GSH-Px水平變化（n=8，U/mL，±s）

a與正常組比較，b與腹腔SM組比較，均P＜0.05；腹腔丙二醇組和氣管丙二醇組不做比較；A與6 h比較，B與24 h比較，C與48 h比較，P＜0.05；表3同

組別正常組腹腔SM組氣管SM組腹腔丙二醇組氣管丙二醇組SOD 6 h 261.67±5.76 803.54±13.76a 620.95±7.49ab 263.10±4.71 263.62±3.68 24 h 261.19±8.50 1 326.81±18.23aA 1 060.60±9.30abA 262.36±4.07 263.84±3.70 48 h 262.66±5.41 1 037.24±19.82aAB 891.80±4.57abAB 261.61±4.07 264.98±3.08 72 h 261.93±7.79 839.05±18.07aABC 735.76±11.21abABC 264.05±3.97 262.83±2.17組別正常組腹腔SM組氣管SM組腹腔丙二醇組氣管丙二醇組CAT 6 h 8.80±1.97 30.08±4.78a 23.14±3.22ab 8.50±1.70 8.29±9.64 24 h 8.82±1.79 51.58±7.13aA 42.89±6.44abA 9.53±1.53 9.78±8.41 48 h 8.47±1.77 40.98±2.38aAB 33.67±4.62abAB 9.15±1.17 6.77±8.42 72 h 8.89±1.09 35.97±1.23aABC 28.53±4.45abABC 8.00±1.78 10.15±8.20組別正常組腹腔SM組氣管SM組腹腔丙二醇組氣管丙二醇組GSH-Px 6 h 101.50±8.11 302.92±10.09a 207.23±11.92ab 109.00±10.52 108.30±11.54 24 h 100.78±7.34 518.32±22.02aA 316.38±8.14abA 106.02±9.82 107.57±10.15 48 h 99.28±5.53 280.88±9.04aAB 188.39±8.71abAB 108.80±8.98 107.46±12.23 72 h 100.58±6.29 189.30±2.66aABC 138.24±9.36abABC 117.95±4.51 109.65±9.69

Tab.2 Comparison of SOD,CAT and GSH-Px repeated measures analysis of variance表2 SOD、CAT及GSH-Px重復測量方差分析比較結果

Fig.1 The positive expression of CuZn-SOD protein in alveolar septum of rats（×400）圖1 各組大鼠肺泡間隔CuZn-SOD蛋白陽性表達（×400）

Fig.2 The positive expression of Mn-SOD protein in alveolar septum of rats（×400）圖2 各組大鼠肺泡間隔Mn-SOD蛋白陽性表達（×400）

Fig.3 The positive expression of PON-1 protein in alveolar septum of rats（×400）圖3 各組大鼠肺泡間隔PON-1蛋白陽性表達（×400）

Fig.4 The positive expression of ApoA1 protein in alveolar septum of rats（×400）圖4 各組大鼠肺泡間隔ApoA1蛋白陽性表達（×400）

Tab.3 The positive expression ratios of CuZn-SOD,Mn-SOD,PON-1 and ApoA-1 proteins in the alveolar septum of rats表3 各組大鼠肺泡間隔CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1及ApoA-1蛋白陽性表達率 （n=8，個/視野，±s）

Tab.3 The positive expression ratios of CuZn-SOD,Mn-SOD,PON-1 and ApoA-1 proteins in the alveolar septum of rats表3 各組大鼠肺泡間隔CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1及ApoA-1蛋白陽性表達率 （n=8，個/視野，±s）

組別正常組腹腔SM組氣管SM組腹腔丙二醇組氣管丙二醇組CuZn-SOD 6 h 6.40±0.72 45.50±2.79a 34.98±3.57ab 6.20±0.51 5.87±0.47 24 h 5.76±0.84 52.72±1.88aA 46.59±3.03abA 5.61±0.34 5.43±0.87 48 h 6.22±0.88 59.91±3.54aAB 52.81±2.55abAB 5.93±0.70 5.59±0.42 72 h 6.13±0.84 73.27±3.09aABC 64.03±2.20abABC 6.05±0.60 5.40±0.64 Mn-SOD組別正常組腹腔SM組氣管SM組腹腔丙二醇組氣管丙二醇組6 h 26.17±2.50 73.20±4.68a 59.44±8.55ab 27.18±2.00 24.01±3.17 24 h 25.82±2.05 97.98±11.78aA 82.83±11.99abA 24.68±3.19 24.81±3.47 48 h 25.80±2.31 147.34±11.46aAB 113.28±16.17abAB 26.76±2.240 25.42±3.09 72 h 25.99±2.31 180.18±13.84aABC 152.62±17.37abABC 26.14±2.92 26.43±1.92組別正常組腹腔SM組氣管SM組腹腔丙二醇組氣管丙二醇組PON-1 6 h 37.33±4.38 49.16±5.41a 43.44±4.22ab 34.42±3.85 34.87±3.34 24 h 37.00±4.51 69.29±3.96aA 57.10±3.86abA 35.06±3.33 35.23±2.94 48 h 34.86±3.31 81.88±7.60aAB 63.28±3.82abAB 35.27±3.07 33.86±2.91 72 h 36.82±4.02 141.13±6.71aABC 88.76±4.26abABC 35.15±3.54 36.16±3.45組別正常組腹腔SM組氣管SM組腹腔丙二醇組氣管丙二醇組ApoA-1 6 h 3.61±0.32 8.80±0.58a 5.50±0.33ab 3.63±0.35 5.50±0.33 24 h 3.48±0.26 11.60±0.83aA 7.28±0.12abA 3.63±0.27 7.28±0.12 48 h 3.39±0.15 16.74±0.87aAB 8.76±0.30abAB 3.49±0.30 8.76±0.30 72 h 3.57±0.24 22.07±2.85aABC 12.84±0.76abABC 3.69±0.27 12.84±0.76

Tab.4 Comparison of CuZn-SOD,Mn-SOD,PON-1 and ApoA-1 repeated measures analysis of variance表4 CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1及ApoA-1重復測量方差分析比較結果

現已證實，SM可通過ROS和活性氮簇信號通路誘導氧化應激反應（細胞色素C 釋放和ROS 蓄積），由此導致細胞的損傷［9］。PON-1是一種多功能抗氧化酶，能水解有機磷酸鹽、芳基酯、內酯類、特異性氧化脂。SOD酶家族有3種亞型，包括細胞質的CuZn-SOD、線粒體的Mn-SOD 和細胞外的（CuZn-SOD）。CuZn-SOD主要在肺纖維上皮高表達；Mn-SOD主要在呼吸道上皮、肺泡Ⅱ上皮細胞、肺泡巨噬細胞、肺間質成纖維細胞適量表達［10］。研究表明，SM肺損傷急性期支氣管肺泡灌洗液和肺組織CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1、ApoA-1 mRNA 表達和蛋白含量增加［11］；而慢性期，其mRNA 表達和含量則明顯降低［12］。這可能與SM 誘導COPD 或毛細支氣管炎相關［13］。上述結果提示，SM急性肺損傷抗氧化標記物升高，機體的抗氧化能力存在。本研究發現，SM（1LD50）經腹腔和氣管途徑均能誘導肺泡間隔CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1、ApoA-1 蛋白呈高表達，且腹腔SM 組表達的陽性細胞亦明顯增加，提示在急性肺損傷期，肺氧化應激反應呈線性上升，符合SM 肺損傷的規律（隨時間延長損傷加重）。這與血清抗氧化酶譜的一過性升高變化不同，說明SM對靶器官肺組織的氧化應激反應呈現持續性狀態。筆者推測，SM誘導肺損傷氧化應激的機制可能與細胞內GSH和硫氧還蛋白耗竭，線粒體膜改變，線粒體電子轉移鏈活性降低，ROS 細胞內蓄積，抗氧化酶減少，氧化相關通道調節和氧化還原內環境維持失調，氧化與抗氧化平衡紊亂，損傷細胞膜脂、蛋白、DNA，最終導致肺水腫、肺表面活性物質損傷、肺氣腫、“芥子氣肺”有關［14］。因此筆者認為，在SM（1LD50）條件下，經腹腔途徑大鼠急性肺損傷氧化應激指標明顯升高，提示SM誘導肺損傷分子水平的氧化應激指標差異可能與染毒途徑有關。

綜上所述，SM 具有獨特的毒理特性，誘導肺損傷的細胞和分子機制復雜且尚不明確，但氧化應激在SM 急性肺損傷機制中的確發揮著重要的作用。本研究經2 種途徑建立等毒性劑量SM 急性肺損傷動物模型，發現腹腔SM 組和氣管SM 組急性肺損傷氧化應激反應存在差異性。同時，SM除經氣管可直接導致肺損傷外，還可經血路間接導致肺損傷。筆者認為，氧化應激可能是SM急性肺損傷的重要機制之一，這可為未來抗氧化劑的研制提供重要的理論依據。