楮實子對藥物性肝損傷大鼠氧化應激因子的影響

王 茜，張一昕，石 鋮，郝 蕾，韓 雪，郭秋紅，張曉棟

河北中醫學院藥學院，河北省高校中藥組方制劑應用技術研發中心，石家莊 050200

藥物性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)是指藥物或其代謝產物引起的肝細胞毒性損害或肝臟對藥物及代謝產物的變態反應所致的疾病。據報道，DILI已成為國內外常見且較嚴重的藥源性疾病之一[1]。研究表明，氧化應激在藥物性肝損傷的發病中具有重要作用，而過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARS)與氧化應激關系密切。過氧化物酶體增殖物激活受體a(peroxisome proliferators activated receptor alpha，PPAR-a)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators activated receptor gamma，PPAR-γ)屬于細胞核受體家族，其功能狀態與肝臟相關疾病(如脂肪肝、肝炎、肝硬化和肝癌)的發生密切相關[2]。

中醫學認為，藥物性肝損傷是藥毒侵犯機體，濕熱毒邪蘊結體內，影響肝膽的正常疏泄功能，從而導致脅痛、黃疸等癥狀。楮實子(Broussonetiae Fructus)為桑科植物構樹Broussonetiapapyrifera(L．)Vent．的干燥成熟果實，主入肝經，味甘性寒無毒，具有益陰清肝、利水消腫的功效。根據DILI濕熱毒邪的病機，楮實子通過清肝，利水消腫的作用能有效去除濕熱邪毒，且現代研究報道，楮實子具有保肝及較強的體外抗氧化作用[3,4]。因此，本文擬通過觀察肝功能指標，揭示楮實子對藥物性肝損傷的保護作用，通過檢測氧化應激指標及PPAR-a和PPAR-γ的基因表達情況，初步探討楮實子可能的作用途徑，為保肝新藥的研發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

動物：清潔級SD大鼠50只，雌雄各半，體質量180 ～ 220 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號：11400700181914，動物生產許可證號：SCXK(京)2012-0001。

主要試劑與試劑盒：谷丙轉氨酶(ALT，批號AUZ3689)和谷草轉氨酶(AST，批號AUZ3645)測定試劑盒均購自貝克曼庫爾特實驗系統有限公司；總膽紅素(TBIL，批號A005)和直接膽紅素(DBIL，批號A006)試劑盒均購自長春匯力生物技術有限公司；超氧化物歧化酶(SOD，批號A001-1)，谷胱甘肽(GSH，批號A006-1)，丙二醛(MDA，批號A003-2)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px，批號A005)，過氧化氫酶(CAT，批號A007-1)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；Trizol(批號：139603)，購自invitrogen公司；TIANScriptcDNA第一鏈合成試劑盒(批號：P5011)，SuperRealPreMix Plus(SYBR Green，批號：Q5922)均購自天根生化科技(北京)有限公司；Anti-ROS1 Rabbit Polyclonal Antibody(批號：D829AA0353)，購自ORIGENE公司。

主要儀器：Humalyzer2000 半自動生化分析儀(德國豪邁公司)、HMIAS-2000顯微圖像分析系統(武漢同濟大學)、熒光定量PCR儀ABI7500(Applied Biosystems)、DP73數碼顯微鏡(日本 Olympus)。

1.2 實驗方法

1.2.1 楮實子藥液制備

楮實子(CSZ)選用廣東一方制藥有限公司生產的中藥配方顆粒(批號為:11080711，當量比為7∶1)，實驗時將楮實子的實驗用生藥劑量按照當量比換算為配方顆粒的劑量，用100 ℃ 蒸餾水充分溶解，冷貯備用。

1.2.2 動物分組與造模

將 50只 SD 大鼠適應性喂養 1 周后，按體重隨機分為5組，每組 10只，即:正常組、模型組、水飛薊賓組、楮實子低、高劑量組 (簡稱低劑量組、高劑量組)。除正常組給予蒸餾水灌胃以外，其余各組用對乙酰氨基酚溶液1 200 mg/kg(用40 ℃生理鹽水配制)每日灌胃1次，連續30天。

1.2.3 給藥方法

從造模第 1 天起，上午造模，下午正常組和模型組給予蒸餾水灌胃，陽性藥和楮實子各劑量組均給予相應藥物。結合臨床應用，選擇臨床成人1日常用劑量10 g作為楮實子低劑量，40 g作為楮實子高劑量，按照人與大鼠體表系數法轉換為實驗用量，低、高劑量組大鼠每日用藥劑量分別為1.05、4.2 g生藥/kg；水飛薊賓組為44 mg/kg。每次用藥體積均為1 mL/100 g，連續給藥30 天，自由進食水，每5 天稱體重一次，根據體重更換灌胃體積。

1.2.4 樣本制備及相關生理生化指標檢測

最后一次灌胃給藥后，各組大鼠禁食不禁水16 h，3.5% 水合氯醛麻醉后腹主動脈取血，分別置于潔凈試管和肝素抗凝管中，4 000 rpm，離心20 min，分離血清和血漿，采用全自動生化分析儀檢測ALT和AST活性、DBIL和TBIL含量；采用紫外分光光度儀按照南京建成試劑盒說明書測定血清中SOD、GSH-PX 和CAT的活性，GSH和MDA的含量。各組大鼠取血后，迅速剖腹取出肝臟，分成若干小塊，取一部分置于4% 多聚甲醛溶液中固定，常規脫水，石蠟包埋，連續切片，HE 染色，光鏡觀察肝組織的形態學變化，運用免疫組化法檢測ROS1的蛋白表達；再取一部分置于凍存管中液氮凍存，-80 ℃冰箱保存，RT-PCR技術檢測肝組織中PPAR-γmRNA、PPAR-αmRNA的表達。

1.2.5 RT-PCR

稱取100 mg肝臟組織，磨碎，加入Trizol 1 mL，冰上勻漿，提取總RNA。參照逆轉錄試劑盒說明進行逆轉錄反應，獲得cDNA。取5μL RNA用1% 瓊脂糖凝膠進行電泳，以檢測其完整性。將完整的cDNA 進行實時熒光定量 PCR 反應，分別用目的基因引物和內參基因引物進行擴增，同時在60～95 ℃進行溶解曲線分析，檢測PPAR-γ、PPAR-α的基因表達，采用2-△△CT法進行數據的相對定量分析。β-actin上游引物5′-CCTCCTGAACTTGAGGCAGTTTA-3′，下游引物5′-CTCTGGGGCTGTCAGTCTTG-3′，PPAR-α上游引物為5′-GAAAGATTCGGAAACTGC-3′，下游引物為5′-TCCTGCGAGTATGACCC-3′；PPAR-γ上游引物為5′-TGGGCGAATGCCACAGG-3′，下游引物為5′-TTTGGTCAGCGGGAAGG-3′。

1.2.6 免疫組化

將多聚甲醛固定的肝組織制作成病理蠟塊，切片后按照試劑盒說明用免疫組化法觀察ROS1的陽性表達，通過軟件分析所測陽性反應物相對含量的灰度值及面積，由積分光密度值(IOD)和平均光密度值(MOD)來表示。

1.3 統計學分析

實驗數據采用SPSS13.5軟件進行處理，計量資料多組間比較采用方差分析，方差齊選用LSD，方差不齊選用非參數檢驗方法；以P<0.05 有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 楮實子對APAP肝損傷大鼠血清肝功能指標的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中ALT 和AST活性、DBIL含量均明顯升高(P<0.05或P<0.01)、TBIL含量有升高趨勢，但無統計學差異(P>0.05)。藥物干預后，各用藥組ALT和AST活性，DBIL和TBIL的含量均較模型組降低。其中水飛薊賓組和低劑量組ALT、AST活性降低明顯(P<0.05或P<0.01)，高劑量組AST活性及DBIL含量顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與高劑量組比較，楮實子低劑量組AST活性的降低更明顯(P<0.05)(見表1)。

表1 楮實子對APAP肝損傷大鼠血清ALT、AST、DBIL、TBIL的影響

注：與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與高劑量組比較，※P<0.05。

Note:Compared with normal group,△P<0.05，△△P<0.01;Compared with model group,▲P<0.05，▲▲P<0.01;Compared with high dose group,※P<0.05.

2.2 楮實子對APAP肝損傷大鼠肝組織病理形態學的影響

正常組大鼠肝小葉結構完整，肝索以中央靜脈為中心呈放射狀排列整齊，肝細胞形態正常，未見明顯病理改變。模型組肝小葉結構破環,肝索排列紊亂，廣泛性肝細胞氣球樣變并伴有壞死。水飛薊賓對照組和楮實子各給藥組大鼠僅在中央靜脈周圍出現局部的肝細胞氣球樣變。尤其是水飛薊賓對照組和低劑量楮實子組肝損傷程度最輕，僅出現個別肝細胞氣球樣變情況(見圖1)。

圖1 楮實子對APAP肝損傷大鼠肝組織病理形態學的影響(HE,100×)Fig.1 Effects of CSZ on the morphology of mouse liver tissues(HE,100×)注：1.正常組；2.模型組；3.水飛薊賓組；4.楮實子低劑量組；5.楮實子高劑量組。Note:1.Normal;2.APAP;3.APAP+silymarin;4.APAP+CSZ (1.05 g/kg);5.APAP+CSZ (4.2 g/kg).

2.3 楮實子對APAP肝損傷大鼠氧化應激指標的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中MDA含量顯著升高(P<0.01)，GSH含量、SOD和GSH-PX活性顯著降低(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，水飛薊賓組MDA含量降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.01)；高、低劑量楮實子組GSH含量、SOD和GSH-PX活性均顯著升高(P<0.05或P<0.01)。與水飛薊賓組比較，低劑量組GSH含量顯著升高(P<0.01)。各組CAT活性無明顯統計學差異(P>0.05)。見表2和表3。

表2 楮實子對APAP肝損傷大鼠血清MDA、GSH含量的影響

注：與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與水飛薊賓組比較，☆☆P<0.01。

Note:Compared with normal group,△P<0.05，△△P<0.01;Compared with model group,▲P<0.05，▲▲P<0.01;Compared with silymarin group,☆☆P<0.01.

表3 楮實子對APAP肝損傷大鼠血清SOD、 GSH-PX、CAT活性的影響

注：與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

Note:Compared with normal group，△P<0.05;Compared with model group,▲P<0.05，▲▲P<0.01.

2.4 楮實子對APAP肝損傷大鼠肝組織中PPAR-α、PPAR-γ mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組、水飛薊賓組、高、低劑量楮實子組PPAR-αmRNA表達水平均顯著降低(P<0.01)，PPAR-γmRNA表達水平升高，其中模型組、水飛薊賓組、低劑量組表達升高有統計學差異(P<0.01或P<0.05)；與模型組比較，水飛薊賓組、高、低劑量組PPAR-αmRNA表達水平均升高，PPAR-γmRNA表達水平均降低，其中高、低劑量組的調控作用尤為明顯(P<0.01)；與水飛薊賓組比較，高、低劑量組PPAR-αmRNA表達水平均顯著提高(P<0.01)、PPAR-γmRNA表達水平均降低(P<0.01)；與高劑量組比較，低劑量組PPAR-αmRNA表達水平降低(P<0.05)(見表4)。

表4 楮實子對APAP肝損傷大鼠肝組織中PPAR-α、PPAR-γ mRNA表達的影響

注：與正常組比較，△△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與水飛薊賓組比較，☆☆P<0.01；與高劑量組比較，※P<0.05。

Note:Compared with normal group,△△P<0.01;Compared with model group,▲P<0.05，▲▲P<0.01;Compared with silymarin group,☆☆P<0.01;Compared with high dose group,※P<0.05.

2.5 楮實子對APAP肝損傷大鼠肝組織中ROS1表達的影響

正常組陽性細胞表達相對較少，著色較淺，模型組大鼠肝組織的細胞陽性表達相對較多，著色較深。對照組、低、高劑量楮實子組陽性細胞的表達及著色程度降低。模型組大鼠肝組織中IOD和MOD較正常組升高(P<0.01或P<0.05)；各用藥組IOD和MOD均低于模型組(P<0.01或P<0.05)，其中，IOD高、低劑量組高于對照組(P<0.01)，高劑量組低于低劑量組(P<0.01);MOD高、低劑量均高于對照組，但無統計學意義(P>0.05)(見表5，圖2)。

表5 楮實子對APAP肝損傷大鼠肝組織中ROS1蛋白表達的影響

注：與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01與水飛薊賓組比較，☆☆P<0.01；與高劑量組比較，※※P<0.01。Note:Compared with normal group,△△P<0.01;Compared with model group,▲P<0.05，▲▲P<0.01;Compared with silymarin group,☆☆P<0.01;Compared with high dose group,※※P<0.01.

3 結論

ALT 和 AST 是臨床應用最廣泛的反映肝細胞損傷的生化指標，但在藥物性肝損傷的早期診斷及識別方面具有一定的局限性[5]。有文獻報道，膽紅素增高是藥物性肝炎死亡及肝衰竭的最佳預測指標。TBIL和DBIL的正常代謝依賴于肝細胞,當肝臟發生炎癥、壞死、中毒等損害時，一方面肝臟無法完全攝取和結合 TBIL，另一方面肝細胞內的 DBIL會從受損的肝細胞釋出，因此導致血液中 DBIL和 TBIL 均升高[6]。本實驗結果顯示，與正常組比較，模型組AST、ALT活性和DBIL含量顯著升高，肝細胞變性、壞死，提示藥物性肝損傷模型成功。采用不同劑量的楮實子給藥，結果顯示楮實子各劑量組血清 ALT、AST活性和DBIL、TBIL含量降低，肝細胞變性程度較模型組減輕，表明楮實子對藥物性肝損傷有良好的修復作用。

圖2 楮實子對APAP肝損傷大鼠肝組織中ROS1蛋白表達的變化(免疫組化，200×)Fig.2 Effects of CSZ on the expression of ROS1 protein in the liver of rats(SP,200×)注：1.正常組；2.模型組；3.水飛薊賓組；4.楮實子低劑量組；5.楮實子高劑量組。Note:1.Normal;2.APAP;3.APAP+silymarin;4.APAP+CSZ (1.05 g/kg);5.APAP+CSZ (4.2 g/kg).

文獻報道氧化應激是對乙酰氨基酚導致肝損傷的重要機制[7]，對乙酰氨基酚 (APAP)過量可引起線粒體氧化損傷、肝細胞壞死，從而導致急性肝衰竭。而作為脂質過氧化反應的終產物之一，MDA是機體內反映氧化損傷程度的經典指標之一。同時肝臟還有多種抗氧化物酶，可抵抗自由基損傷，如SOD、CAT和GSH-Px共同形成抗氧化物酶體系[8]。GSH是一種低分子自由基清除劑，又是GSH-Px的底物，能防止細胞因子受氧化損傷。脂質過氧化作用將活性氧轉化為活性化學劑，通過鏈式或鏈式支鏈反應放大活性氧的作用，同時由于活性氧積聚，使肝組織的抗氧化物質消耗增加，使SOD 、CAT、 GSH-Px、GSH表達量下降[9]。實驗結果表明，模型組大鼠肝組織 MDA 含量高于正常組，SOD 、GSH-Px和GSH水平明顯低于正常組，提示肝損傷大鼠有脂質過氧化損傷及抗氧化物酶體系的減弱。而楮實子各劑量組的肝組織 MDA 含量低于模型組，SOD 、GSH-Px和GSH水平高于模型組，提示其具有抗氧化，清除自由基的作用。

ROS1是Ⅱ類受體酪氨酸激酶的胰島素受體基因，被認為是多種信號通路的啟動因子，在正常的機體狀態下其被嚴格控制不發揮作用，一旦受到致病因子的刺激，則可誘導細胞發生氧化應激反應[10]。因此，ROS1可認為是氧化應激發生的一個啟動因子，如果能抑制ROS1的表達，則可延緩或抑制氧化應激的發生發展過程。PPAR-α和PPAR-γ均是配體活化的轉錄因子，屬于核激素受體超家族成員。近年來研究發現，PPAR-α及其配體對氧化應激誘導的藥物性肝損傷有良好的調控作用，激活 PPAR-α可抑制肝細胞缺氧/復氧損傷的脂質過氧化反應，減輕大鼠肝細胞缺氧/復氧損傷的氧化應激損傷，保護肝功能。PPAR-γ可被特異性配體激活而在細胞增殖分化、炎癥調控、凋亡、抑制肝臟氧化應激過程中發揮重要作用[11-13]。劉芳等研究發現，PPAR-γ的表達在 LPS/D-GalN誘導的急性肝損傷模型組中顯著增高，與以往研究結果相反，認為在急性肝損傷中PPAR-γ的表達升高可能是一種應激性反應[14]。另有文獻報道，肝細胞中PPAR-γ的表達可抑制脂代謝，促進肝臟脂肪變性[15]。本文結果顯示，模型組大鼠ROS1蛋白表達以及PPAR-γ基因表達高于正常組，而PPAR-α基因表達低于正常組，楮實子各劑量組ROS1蛋白的表達和PPAR-γ基因表達均有不同程度的降低，PPAR-α基因表達基因表達有不同程度的升高，以高劑量組效果較好。

綜上所述，楮實子能有效防治對乙酰氨基酚所致肝損傷，其機制可能與ROS1蛋白控制了氧化應激的啟動，轉錄因子PPAR-α對藥物性肝損傷所發生的氧化應激起到正向調控的作用，PPAR-γ則為反向調控的作用，結合文獻報道分析PPAR-γ是否對氧化應激性損傷發揮保護作用有爭議，一方面認為PPAR-γ過表達為機體抗炎的應激性反應。另一方面，PPAR-γ過度表達通過抑制脂代謝，促進肝臟脂肪變性。因此，后續實驗會選擇加入PPAR-γ的激動劑或抑制劑，設置不同的對乙酰氨基酚給藥時間、給藥劑量，觀察氧化應激、炎性因子、脂質代謝、PPAR-γ等指標的變化，以期最終揭示楮實子對PPAR-γ的反向調控是否為保肝作用的機制。