不同產地女貞子化學質量特征分析

祝俠麗，張迪文，謝彩俠*，雷敬衛

1河南中醫藥大學藥學院，鄭州 450046；2 河南省中醫研究院中藥研究所，鄭州 450006

女貞子為木犀科女貞屬植物女貞(LigustrumlucidumAit.)的干燥成熟果實，具有滋補肝腎，明目烏發的療效[1]，是一味傳統的扶正固本藥物。女貞子喜光耐蔭，主要分布在我國廣東、浙江、湖南、湖北、四川、河南等暖濕潤氣候地區，研究發現，不同產地的女貞子有效成分的含量差異較大[2]，而在女貞子臨床用藥過程中，并未對女貞子的產地做明確規定及要求，2015年版《中國藥典》也僅僅用特女貞苷作為女貞子質量評價的主要指標，不能真實反映和區分不同產地女貞子質量的差異，影響了女貞子質量評價的準確性及臨床用藥的合理性。

中藥材功效的產生是其內在多種化學成分相互協同產生的，單純的指標性成分并不能真實反映與其功效相一致的藥效物質，而HPLC指紋圖譜提供的化學質量信息豐富，可以相對全面的表征中藥的整體化學質量特征，目前已廣泛應用于中藥材的產地鑒別及質量控制中[3,4]。本研究基于HPLC指紋圖譜的優點及女貞子藥材在生產中存在的問題，收集全國主要產區的女貞子藥材，對其中的女貞苷、特女貞苷及紅景天苷的含量進行測定，并分析比較其HPLC指紋圖譜特征，為不同產地女貞子質量特征的確定、女貞子質量控制標準的完善及女貞子藥材質量可追溯系統的構建提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2695自動高效液相色譜儀(配有Waters2998檢測器)；Dikma Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱(北京迪馬科技有限公司)；CPA225D十萬分之一分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；ME54E型萬分之一分析天平(梅特勒-托利多國際貿易有限公司)；TY-500型超聲波清洗儀(北京天佑恒達科技有限公司)；SZ-93型自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；SZFJ-300型多用藥材粉碎機(廣州市旭朗機械設備有限公司)；DZEW-5型電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業儀器有限公司)。

1.2 試藥

甲醇和乙腈(色譜純，Tedia Company)；甲醇和乙醇(分析純，天津市致遠化學試劑有限公司)；娃哈哈純凈水；蒸餾水(自制)；特女貞苷、女貞苷、紅景天苷對照品(批號分別為MUST-14040402、MUST-14062606、MUST-14071814，純度均≥98%，成都曼思特生物科技有限公司。)

1.3 樣品來源

收集河南、湖南、四川、浙江4個產區不同產地的女貞子飲片24批(見表1)。將女貞子飲片粉碎過40目篩，放于干燥器中保存備用。

表1 不同產地女貞子樣品信息

2 內容與結果

2.1 不同產地女貞子中特女貞苷、女貞苷及紅景天苷含量測定

特女貞苷的含量測定參考2015版《中國藥典》中女貞子含量測定項下的方法。女貞苷及紅景天苷的含量測定均按照文獻[5]中所建立的方法進行測定，每個樣品重復三次，取其平均值。三種成分對照品和女貞子樣品的高效液相色譜圖分別見圖1、圖2、圖3。不同產地女貞子特女貞苷、女貞苷及紅景天苷的含量測定結果見圖4。

由圖4知，不同產地女貞子中特女貞苷含量最高，女貞苷含量次之，紅景天苷含量最低，三種成分的含量受產地的影響較大，女貞苷、特女貞苷和紅景天苷在女貞子藥材中含量的波動范圍分別為0.92%～3.12%、3.96%～7.45%和0.05%～0.15%，而且四個產地之間表現的特征不同。其中，河南產地三個產區的特女貞苷及紅景天苷含量相對穩定，而女貞苷含量有一定差異；湖南產地三個產區之間女貞苷含量差異相對較小，特女貞苷及紅景天苷含量差異較大；四川產地不同產區之間女貞子中紅景天苷含量較為穩定，其他兩個指標變化較大；浙江產地兩個產區三個指標的含量均有明顯差異。另外，四個產地中湖南產地女貞子中女貞苷的含量整體較高，河南和四川兩個產地的含量比較接近，單因素方差分析表明，四個產地之間無顯著性差異；四川和河南兩個產地女貞子中特女貞苷含量整體較高，但四個產地之間無顯著性差異；四川產地女貞子中紅景天苷含量較高，與其他三個產地的女貞子之間存在顯著性差異(P<0.05)。

圖1 女貞子中特女貞苷HPLC色譜圖(A：對照品；B：樣品)Fig.1 HPLC of the specnuezhenide of Ligustri Lucidi Fructus(A:control;B:sample)

圖2 女貞子中女貞苷HPLC色譜圖(A：對照品；B：樣品)Fig.2 HPLC of the ligustroflavone of Ligustri Lucidi Fructus(A:control;B:sample)

圖3 女貞子中紅景天苷HPLC色譜圖(A：對照品；B：樣品)Fig.3 HPLC of the salidroside of Ligustri Lucidi Fructus(A:control;B:sample)

圖4 不同產地女貞子中三種成分的含量 (A：河南；B：湖南；C:四川；D：浙江)Fig.4 The content of specnuezhenide,ligustroflavone and salidroside of Ligustri Lucidi Fructus from different producing areas (A:Henan;B:Hunan;C:Sichuan;D:Zhejiang)

2.2 女貞子HPLC指紋圖譜方法的建立

2.2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取女貞苷、特女貞苷、紅景天苷對照品適量，分別加甲醇制成濃度為0.113、0.145、0.183 mg/mL的女貞苷、特女貞苷和紅景天苷對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱定女貞子粉末約0.4 g，置具塞錐形瓶中，精密量取稀乙醇25 mL，稱定重量，加熱回流1h，放冷，稱重，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，過濾后即得供試品溶液。

2.2.3 色譜條件

色譜柱：Dikma Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(0～25 min：10%乙腈→25%乙腈)；25～50 min：25%乙腈)；流速：1 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：35 ℃；檢測波長：275 nm。

分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液20 μL注入高效液相色譜儀中，按照上述色譜條件進行測定，對照品及供試品溶液的高效液相色譜圖見圖5。

圖5 對照品(A)和女貞子樣品(B)HPLC指紋圖譜(a：紅景天苷；b：女貞苷；c：特女貞苷)Fig.5 HPLC fingerprints of control(A)and Ligustri Lucidi Fructus(a:salidroside;b:ligustroflavone;c:specnuezhenide)

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 精密度試驗

精密稱取S-XF13號女貞子粉末，按照“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，按照“2.2.3”項下的色譜條件進樣，連續進樣6次，記錄色譜圖中共有峰的保留時間和峰面積，以共有峰12號峰作為參照峰，計算主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值，結果表明相對保留時間的RSD值在0.00%～0.31%之間，相對峰面積的RSD值在0.00%～1.32%之間，符合指紋圖譜的要求。

2.2.4.2 重復性試驗

精密稱取H-ZM2號樣品6份，按照精密度試驗的方法獲取6份供試品溶液的指紋圖譜，并計算其主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值，結果表明相對保留時間的RSD值在0.00%～ 0.40%之間，相對峰面積的RSD值在0.00%～2.21%之間，符合指紋圖譜的要求。

2.2.4.3 穩定性試驗

精密稱取H-ZZ5號樣品粉末，按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，分別放置0、2、4、8、12、24 h后測定其相應指紋圖譜，并計算主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值，結果表明相對保留時間的RSD值在0.00%～ 0.31%之間，相對峰面積的RSD值在0.00%～2.17%之間，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3 不同產地女貞子HPLC指紋圖譜特征分析

2.3.1 不同產地女貞子HPLC指紋圖譜共有模式的生成

分別從河南、湖南、四川、浙江4個省份中各選取4批代表性的女貞子樣品粉末，按照2.2項下的方法獲取16批女貞子樣品的HPLC指紋圖譜(見圖6)。采用國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版》軟件進行數據分析，設S1為參照圖譜，設定時間窗寬度為0.3，采用中位數法，通過自動匹配及多點校正生成指紋圖譜的共有模式(見圖7)，共標定14個共有峰。結果顯示，不同產地女貞子HPLC指紋圖譜色譜峰的數目基本相同，說明不同產地女貞子的化學成分種類基本一致，但其中2號峰、紅景天苷、4號峰、6號峰、女貞苷及14號峰等的峰面積差異較大。

圖6 16批女貞子HPLC指紋圖譜疊加圖Fig.6 Vertical overlap of HPLC fingerprints for 16 batches of Ligustri Lucidi Fructus

圖7 女貞子飲片HPLC指紋圖譜共有模式(3：紅景天苷 11：女貞苷 12：特女貞苷)Fig.7 HPLC fingerprint common pattern of Ligustri Lucidi Fructus(3:salidroside;11:ligustroflavone;12:specnuezhenide)

2.3.2 不同產地女貞子指紋圖譜相似度分析

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版》軟件，以生成的女貞子指紋圖譜的共有模式為標準，其相似度為1.000，對不同產地女貞子HPLC指紋圖譜進行相似度計算，并對各樣品圖譜間的相似度進行評價(見表3)。

表3 不同產地女貞子HPLC指紋圖譜相似度

由表可知，不同產地女貞子指紋圖譜的相似度差異較大，河南及浙江女貞子與女貞子的共有模式相比，指紋圖譜的相似度均在0.9以上，說明這兩個產地的女貞子質量基本可以代表女貞子的質量特征；湖南與四川產地的女貞子相似度較低，而且四川不同樣品之間差異較大，說明這兩個產地的女貞子除了具有所有女貞子質量特征的共性外，還表現出明顯的地域性特征，這可能與湖南、四川的氣候環境有一定關系。

2.3.3 不同產地女貞子HPLC指紋圖譜的主成分分析和聚類分析

為篩選引起不同產地女貞子質量差異的特征成分，比較不同產地女貞子樣品之間化學質量的相似性，為不同產地女貞子質量特征的確定提供科學依據，本研究進一步對指紋圖譜進行了主成分分析和聚類分析。

2.3.3.1 主成分分析

將不同產地女貞子HPLC指紋圖譜共有模式中共有峰的相對峰面積及保留時間分別作為原始信息數據導入SPSS 19.0軟件進行主成分分析。設特征值1為提取標準，選擇合適的主成分數，使方差貢獻率累計值達到78%～ 90%，以保證提取的信息基本涵蓋原樣品的特征，以準確反映不同產地16批樣品之間的質量表達差異性。經過對四個產地16批女貞子樣品HPLC指紋圖譜主成分分析得到各主成分的特征值(見表4)、主成分數的碎石圖(圖6)及各主成分所代表的共有峰的矩陣(見表5)。

主成分的貢獻率反映了該成分所代表的色譜峰對原變量的解釋度。不同產地女貞子HPLC指紋圖譜主成分分析中的主成分特征值及碎石圖分析結果表明，前5個主成分方差貢獻率綜合達到78.007%，它們基本反映了16批樣品指紋圖譜中的大部分信息。主要因子載荷矩表結果顯示第1主成分主要反映了色譜峰4、6、9、14的信息，其中6號峰的載荷最高；第2主成分主要反映了色譜峰8、女貞苷的信息，其中女貞苷的載荷最高。第3主成分主要反映了色譜峰1、紅景天苷、13的信息，其中紅景天苷的載荷最高；第4主成分主要反映了色譜峰2、8的信息，其中8號峰的載荷最高。因此，除特女貞苷外，6號色譜峰所代表的成分、女貞苷、紅景天苷及8號色譜峰所代表的成分可能是引起不同產地女貞子質量特征差異的主要指標。

表4 主成分特征值

2.3.3.2聚類分析

分別將四個產地16批女貞子指紋圖譜共有峰的相對保留時間及峰面積導入SPSS 19.0軟件對其進行聚類分析，選擇組間連接為聚類分析的方法，平方歐式距離為距離的測量公式，繪制聚類分析的樹狀圖(見圖7)(s1 ～ s4為河南女貞子樣品；s5 ～ s8為湖南女貞子樣品；s9 ～ s12為四川女貞子樣品；s13 ～ s16為浙江女貞子樣品)。由聚類分析結果知，不同產地的女貞子樣品質量特征相互交叉，無明顯規律性，而且相同產地的女貞子樣品也并沒有聚為一類。

表5 主要因子載荷矩陣表

圖8 碎石圖Fig.8 Scree plot

圖9 不同產地女貞子HPLC指紋圖譜聚類分析Fig.9 The systematic cluster analysis of HPLC fingerprint of Ligustri Lucidi Fructus from different areas

3 討論

中藥材生長過程中產生的次生代謝產物是中藥材產生臨床功效的物質基礎，也是評價中藥材質量優劣的重要指標。次生代謝產物含量的高低受藥材品種[6,7]、產區環境[8]、栽培方式[9]、采收時期[10]、加工方式[11]等多種因素的影響，而且不同種類的次生代謝產物，決定其合成與積累的關鍵生態因子及人文因子不同。本研究結果表明，由于女貞子在我國分布較為廣泛，不同產地生態環境及栽培管理措施差異較大，導致了女貞子中女貞苷、特女貞苷及紅景天苷的含量及不同產區三種成分的表現特征均具有一定的差異，其中紅景天苷含量受產地的影響較大，表明了中藥材質量的形成主要是種質與環境共同作用的結果。

道地藥材是在特定地域與特定生長環境，并通過特定的生產加工過程生產的，較其他產地的同種藥材質量好、品質佳、療效好的，具有較高知名度與認可的中藥材，具有明顯的地域性。一般情況下，分布較為廣泛的藥材對生長環境的要求相對較低，地域性不明顯，因此藥材的產地質量特征可能并不明顯，而中藥材是一種多組分通過多靶點產生臨床功效的特殊藥品，單純的幾個化學成分并不能真實反映與其臨床功效相一致的質量特征，HPLC 指紋圖譜則可以較為全面的評價藥材的整體化學質量，相對真實的反映其臨床功效。本研究以女貞子中女貞苷、特女貞苷及紅景天苷等環烯醚萜苷和苯乙醇苷類成分為指標建立了四個產地不同來源的16批女貞子樣品HPLC指紋圖譜來表征女貞子的化學質量，同時利用相似度分析、主成分分析和聚類方法分析不同產地女貞子的質量特征差異。相似度分析表明不同產地女貞子在化學成分種類一致的情況下，其差異主要體現在某些化學成分含量的高低上，其中河南、浙江兩產地的女貞子藥材質量特征比較接近，而湖南、四川兩產地的女貞子與河南、浙江的差異較大，但聚類分析結果表明四個產地的女貞子藥材質量特征相互交叉，并沒有表現出區別于其他產地的明顯特征。這與相似度分析的結果不太一致，因此在評價不同產地藥材化學質量特征時，應盡可能同時采用多種分析方法，以真實反映不同產地藥材的質量差異。

特女貞苷是女貞子中含量較高的一種環烯醚萜苷類成分，具有明顯的藥理作用，因此，2015 年版《中國藥典》以特女貞苷含量作為控制女貞子質量的指標具有一定的合理性。主成分分析表明，女貞苷和紅景天苷在內的10個色譜共有峰均不同程度的參與了不同產地女貞子質量差異的表達，而女貞苷和紅景天苷均具有與女貞子滋補肝腎功效相一致的藥理活性[12]，但2015版《中國藥典》并沒有將其作為評價女貞子質量的指標性成分。因此為了科學全面的反映不同產地女貞子質量，女貞子的質量標準還有待于進一步研究與完善。