維生素E琥珀酸酯通過酸性神經磷脂酶-神經酰胺誘導胃癌細胞凋亡的機制研究

張旭光，杜瑞琥，陳彥平，趙 艷*

(1．哈爾濱市兒童醫院兒童保健科，黑龍江哈爾濱 150010；2．哈爾濱醫科大學公共衛生學院預防醫學專業，黑龍江 哈爾濱 150081；3．哈爾濱醫科大學營養與食品衛生學教研室，黑龍江 哈爾濱 150081)

胃癌是一種常見的惡性消化道腫瘤，臨床上治療胃癌的手段主要有手術與化療，但常規化療藥物副作用大，加之腫瘤細胞常對化療藥物產生耐藥，從而限制了化療藥物的臨床應用[1]。維生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate，VES)是天然維生素E的衍生物，VES對胃癌等多種腫瘤細胞均能表現出極強的殺傷作用，而對正常細胞卻無任何毒副作用。本課題組前期研究結果表明VES能夠通過激活酸性神經磷脂酶(acid sphingomyelinase，ASmase)作為起始因子來促進胃癌細胞發生凋亡，其下游信號通路包含了內質網應激途徑，但ASMase早期活化后其下游因子神經酰胺的聚集情況還未明確[2]。此外，本課題組早期研究還發現VES能夠通過死亡受體信號通路、氧化應激途徑促進人胃癌細胞發生凋亡，而ASMase與上述兩條信號通路之間的關系也尚未明確[3-4]。因此，本研究擬進一步探討VES通過ASMase促進人胃癌細胞發生凋亡過程中神經酰胺的聚集變化、死亡受體信號通路及氧化應激反應在這一過程中的作用，以進一步明確VES在促進人胃癌細胞發生凋亡過程中各信號通路的上下游關系。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

低分化人胃癌細胞株SGC-7901由哈爾濱醫科大學營養與食品衛生學教研室保存。VES、ASMase抑制劑地昔帕明(desipramine，DES)與抗Cer抗體均購自美國Sigma公司，ASMase活性試劑盒購自美國Echelon Biosciences公司，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)購自美國Invitrogen公司；活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)探針購自碧云天生物技術研究所；Fas、DR5、caspase-8、caspase-9以及PARP多克隆抗體均購自美國Cell Signal公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與分組 人胃癌SGC-7901細胞在含有10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100μg/mL鏈霉素以及100 U/mL青霉素的RPMI-1640培養基中培養，培養箱條件為溫度37℃，CO2體積分數5%。待其生長狀態良好后，用0.02%EDTA消化傳代，細胞鋪滿85%瓶底面積時，棄去原培養液，更換為2%RPMI-1640培養液并加受試物處理：VES組用20 μg/mL VES處理細胞；VES+DES組用12.5μmol/L DES預處理細胞2 h，再加20μg/mL VES處理細胞；陰性對照組用2%RPMI-1640培養液處理細胞；DES組用12.5μmol/L DES提前2 h處理細胞。分別在不同時間點檢測VES組和VES+DES組中ASMase和Cer的表達情況來確定兩者表達高峰的出現時間和DES對兩者的抑制作用。根據本課題組前期研究結果，選擇VES作用后細胞發生凋亡最明顯的時間點(24 h)檢測4組細胞的凋亡率、死亡受體信號通路蛋白表達和氧化應激情況。

1.2.2 ASMase活性檢測 收集VES組、VES+DES組0、1.5、3、6 h的細胞各1.5×106個，超聲裂解后取上清液20μL(含20μg蛋白)分別置于96孔板內，每孔加入1∶40稀釋的底物50μL，于37℃下震蕩孵育3 h后加入50μL終止液，以酶標儀在360 nm激發光以及460 nm發射波長檢測吸光度，代入到標準曲線中計算ASMase活性。

1.2.3 Cer蛋白表達檢測 采用免疫熒光染色法測定VES組、VES+DES組在0、1.5、3、6、9 h細胞中的Cer蛋白表達。6孔板中細胞用冷PBS清洗2次后在室溫下用4%多聚甲醛固定15 min，清洗細胞后室溫下以0.1%的Triton X-100處理15 min，阻斷緩沖液孵育1 h，用4μg/mL的抗Cer抗體孵育細胞過夜后再用二抗孵育1 h，用激光共聚焦儀獲取圖像。

1.2.4 DAPI染色檢測凋亡率 收集培養基中的死亡細胞和貼壁生長的細胞至Eppendorf管中，洗細胞2次，每管加入2μg/mL的DAPI 50μL，吹打混勻后在37℃、避光條件下孵育30 min，洗細胞2次后取細胞懸液滴于載玻片上，在300～500 nm紫外波長下以倒置熒光顯微鏡觀察凋亡小體(目鏡×物鏡=400)，每組均隨機選取不低于100個細胞的視野計數陽性細胞，計算百分比并拍照。

1.2.5 死亡受體相關蛋白的表達檢測 以Western blot法檢測各組細胞中Fas、DR5、caspase-8、caspase-9以及PARP的蛋白表達情況。收集各組處理24 h的細胞，裂解并提取蛋白，等量上樣，SDS-PAGE電泳分離后常規轉膜、封閉，與一抗雜交過夜，再用堿性磷酸酶標記的二抗于37℃條件下孵育1 h，用數字成像儀對圖像進行拍照并分析。

1.2.6 檢測氧化應激反應 將各組細胞收集后懸浮于終濃度為10μmol/L的2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽中，使細胞濃度為5×106/mL，37℃下避光孵育30 min，每隔3～5 min顛倒混勻一次，之后用培養液洗細胞2次備用。以流式細胞儀檢測各組細胞的氧化應激反應發生率(激發波長488 nm，發射波長525 nm)。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0統計學軟件對實驗數據進行統計分析，統計結果以xˉ±s表示，對照組、DES組、DES+VES組及VES組細胞的凋亡率，DR5、Fas、c-caspase-8、c-caspase-9和c-PARP蛋白表達，氧化應激反應發生率間差異的分析均采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 各組細胞中ASMase活性

按試劑盒方法制作標準曲線為Y=192.08 X+2 183.17(r=0.998)，提示ASMase活性與相對熒光單位間的相關性良好。VES處理細胞0、1.5、3、6 h后細胞中ASMase比活力分別為476.35、658.60、923.85和717.90 U/mg，提示VES處理后胃癌細胞中的ASMase活性隨時間逐漸增加，在3 h達到高峰，隨后逐漸降低；DES+VES組細胞中的ASMase活性在上述時間點的比活力分別為87.75、93.80、98.55和98.70 U/mg，提示DES抑制了SGC-7901細胞中ASMase的基礎活性及VES的促ASMase表達作用，結果見圖1。

2.2 各組細胞中Cer蛋白的表達

圖1 酶聯免疫吸附實驗檢測SGC-7901細胞的ASMase活性

采用免疫熒光法檢測VES處理0、1.5、3、6、9 h后細胞中的Cer蛋白表達情況，結果發現Cer蛋白在Ves處理1.5 h開始升高并聚集于細胞膜上，在6 h時的熒光強度最高，隨后開始降低；以DES抑制ASMase活性后，再以VES處理細胞，結果發現細胞中Cer在0、1.5、3、6、9 h的表達均受到抑制，提示DES能夠通過抑制ASMase活性來抑制Cer的表達，見圖2。

圖2 免疫熒光法檢測SGC-7901細胞Cer蛋白的表達情況

2.3 各組細胞的凋亡率

VES處理24 h后，對照組細胞鏡下細胞核均完整，染色質均勻，無凋亡小體出現；DES組細胞鏡下細胞核及染色質情況與對照組基本一致；VES組細胞鏡下有大量的細胞核發生碎裂，染色質固縮，出現典型的凋亡小體；VES+DES組細胞與VES組相比，核質和染色質相對均勻完整，凋亡小體數量明顯減少，提示抑制ASMase后，VES促進胃癌細胞發生凋亡的作用被降低，統計3次平行實驗結果，發現對照組與DES組的凋亡率無顯著差異[分別為(2.00±1.00)%和(2.67±0.57)%，P＞0.05]，DES+VES組凋亡率[(20.00±2.00)%]高于對照組和DES組(P均＜0.01)，低于VES組[(41.00±1.00)%，P＜0.01]，見圖3。

2.4 ASMase對死亡受體信號通路的影響

采用Western blot法檢測各組細胞中Fas、DR5、caspase-8、caspase-9以及PARP蛋白的表達。結果發現對照組及DES處理組細胞中的上述因子表達量差異均無統計學意義(P均＞0.05)，提示DES本身不會促進上述因子的表達；VES+DES組細胞中上述因子的表達水平較單獨VES處理組降低(P均＜0.01)，提示抑制ASMase活性后，VES促進死亡受體信號通路表達的作用也受到了抑制，見圖4。

圖3 DAPI染色檢測SGC-7901細胞的凋亡率

圖4 Western blot法檢測細胞中DR5、Fas、caspase-8、caspase-9和PARP的蛋白表達水平

2.5 ASMase對氧化應激反應的影響

藥物作用24 h后，以活性氧探針處理細胞，采用流式細胞術檢測細胞發生氧化應激的比例，檢測結果見圖5。表明對照組發生氧化應激的細胞比例為(0.12±0.06)%；DES組細胞發生氧化應激的比例與對照組基本一致(P＞0.05)，說明DES不引起細胞發生氧化應激反應；VES組細胞發生氧化應激反應的比例[(91.22±3.88)%]明顯高于對照組(P＜0.01)，而VES+DES組細胞發生氧化應激反應的比例[(64.04±2.58)%]較VES組明顯降低(P＜0.01)，提示ASMase參與了VES誘導胃癌細胞發生氧化應激反應的過程。

3 討論

圖5 流式細胞術檢測SGC-7901細胞中發生氧化應激反應的比例

目前在胃癌的常規治療手段中化療的毒副作用較大，在殺傷腫瘤細胞的同時亦殺傷正常的組織和細胞。VES具有極強的抑癌活性，能夠選擇性抑制多種屬來源的腫瘤細胞增殖并誘導細胞發生凋亡，但機制還未完全明確。本研究探討了ASMase在VES促進人胃癌SGC-7901細胞發生凋亡過程中Cer、氧化應激反應和死亡受體信號通路的表達，結合前期研究結果[2]，發現：①VES處理早期即可促進細胞中ASMase活性升高；②VES能夠促進Cer表達并聚集在細胞膜上；③抑制ASMase部分阻斷了VES促進細胞發生凋亡的作用；抑制了Cer、Fas、DR5、裂解的caspase-8、caspase-9以及PARP的表達；抑制了細胞內發生的內質網應激以及氧化應激反應，提示VES可能是通過ASMase來促進Cer的表達做為上游調節因子，再分別通過死亡受體信號通路、內質網應激和氧化應激反應3條通路來共同促進胃癌SGC-7901細胞發生凋亡的。

ASMase被激活后會迅速從細胞內囊泡轉移到質膜的外葉[5]，進而水解膜鞘磷脂生成Cer，后者在細胞膜中的積累導致了質膜的重建和富含神經酰胺的平臺的形成，稱為“脂質筏”[6]，并促進Fas和DR5的聚集并使它們與其配體相結合，導致死亡受體依賴性凋亡的發生。本研究結果首次驗證了VES能夠激活ASMase/Cer做為上游調節因子，促進下游的Fas和DR5表達，再使caspase-8裂解為c-caspase-8，通過線粒體途徑激活caspase-9及其下游因子，使細胞中的DNA修復酶PARP被剪切，最終誘導胃癌SGC-7901細胞發生凋亡，與Li等人[7]發現α-生育酚醚鏈乙酸在誘導乳腺癌細胞發生凋亡和Palau等人[8]報道的γ-生育三烯醇在誘導胰腺癌細胞發生凋亡時的機制相同。因此，我們認為ASMase/Cer-死亡受體信號途徑可能是具有抗癌活性的維生素E衍生物誘導腫瘤細胞發生凋亡的共同機制。

在正常情況下細胞內的ROS處于正常水平，并不會對細胞造成損傷，當細胞受到不利的外來刺激時會使ROS在細胞內蓄積從而發生氧化應激反應[9]。本研究的結果表明VES能夠誘導SGC-7901細胞發生氧化應激反應來促進細胞發生凋亡，與本課題組之前的結果相一致[3]。但以DES抑制ASMase活性后，VES誘導SGC-7901細胞發生凋亡和活性氧蓄積的能力僅被部分阻斷，說明ASMase/Cer可能僅是VES誘導胃癌細胞發生氧化應激反應的機制之一。目前ASMase與ROS之間的上下游關系還存在爭論，也有研究表明細胞中ROS能夠調節ASMase進而促進細胞發生凋亡，提示氧化應激反應可能是ASMase的上游信號通路[10]，因此我們推測在VES誘導SGC-7901細胞發生凋亡的過程中ASMase與氧化應激反應可能存在交互作用。此外，本課題組前期研究表明VES在促進胃癌細胞發生凋亡過程中氧化應激反應與內質網應激反應也存在交互作用，因此，推測ASMase、氧化應激反應和內質網應激三者之間均存在交互作用，有待于下一步工作來明確上述推論。

綜上所述，本研究結果發現ASMase/Cer可能是VES通過死亡受體信號通路及氧化應激反應促進胃癌SGC-7901細胞發生凋亡過程中的上游因子，其下游途徑包括死亡受體信號通路以及氧化應激反應，但抑制ASMase活性后，VES的促凋亡和活性氧蓄積的作用并未被完全阻斷，推測ASMase與ROS之間存在交互作用，有待于進一步研究。