沉默表皮生長因子受體的表達對肺腺癌A 549細胞自噬的影響

馬 陽，吳 娟，紀曉坤，王 蕊，杜 蕓*，王 珩，郭 曉，張 艷

(河北醫科大學第四醫院癌檢中心，河北 石家莊 050011)

肺癌是我國現階段發病率和死亡率較高的惡性腫瘤，嚴重威脅著人們的生命，其中非小細胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)占肺癌類型的85%～90%。對于晚期非小細胞肺癌遠處轉移患者，放療、化療等非手術治療常對機體有害，降低了患者的生活質量，且療效有限[1]。因此，探索肺癌發生的機制，對于肺癌患者尋找新的治療方法具有重要意義。

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是屬于酪氨酸激酶型受體，EGFR可與細胞外配體，例如表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)，結合形成二聚體，啟動細胞內信號轉導，調節細胞正常活動，通過細胞質內銜接蛋白和酶的級聯反應來調節轉錄因子激活基因，影響細胞增殖、分化、遷移、黏附及凋亡[2-4]。而在腫瘤細胞中，EGFR基因通常發生過表達或突變，引起酪氨酸活化后，會導致腫瘤細胞存活、增生、侵襲和轉移。研究表明EGFR過表達在NSCLC細胞很常見，并且與預后不良和化療耐藥密切相關[5-7]。

自噬(autophagy)同樣廣泛存在于人體的細胞中，參與各種生理病理過程，細胞自噬過程可以降解一些蛋白與細胞器供細胞循環利用，從而維持細胞穩態[8]。自噬活動及其相關基因的表達與腫瘤的發生發展有著密切的關系。微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1-light chain 3，MAP1-LC3)是參與自噬小體形成的重要蛋白，定位于自噬泡和自噬泡表面，參與自噬體的形成，是目前觀察自噬現象是否存在及自噬活性最為可靠的生物學指標[9]。為此，我們通過轉染體外特異性siRNA來沉默肺腺癌細胞A549的表皮生長因子受體EGFR的表達，研究其對細胞自噬活性的影響，為探索肺腺癌病理生理機制提供理論基礎，為肺腺癌臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌細胞株A549由河北醫科大學病理研究室提供；OPTI培養液、Lipofectamine?RNAiMAX Reagent和小干擾RNA均購于Invitrogengon公司；Real-time RT-PCR試劑盒購于Promega公司；總蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購于北京Solarbio科技技術有限公司；鼠抗人LC3單克隆抗體、鼠抗人EGFR單克隆抗體、β-actin抗體及HRP標記的抗鼠二抗均購于美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 A549細胞培養于含10%胎牛血清、10%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養基中，置于37℃、CO2體積分數為5%的培養箱中，用0.25%的胰酶消化傳代培養。

1.2.2 EGF處理A549細胞 將處于對數生長期的A549細胞用0.25%胰酶消化后，按2×105個/mL的濃度接種于6孔培養板中，分為4個組，分別為未處理組和EGF 10、25、50 ng/mL處理組，待作用24 h后檢測EGFR蛋白的表達水平。

1.2.3 肺腺癌細胞EGFR siRNA瞬時轉染 A549細胞按2×105個/mL接種于6孔板中，待細胞鋪滿90%～95%孔底面積時，更換培養基為無血清培養基。將100μL無血清OPTI培養液與7.5μL Lipofectamine?RNAiMAX Reagent加入無菌EP管中輕輕混勻，100 μL無血清OPTI培養液與原濃度為20μmol/L的EGFR特異性siRNA 5μL在另一無菌EP管中輕輕混勻后，將2個管移入1個EP管中再輕輕混勻，靜置5 min，兩者混合制備轉染復合物，室溫靜置25 min形成siRNA-轉染試劑混合液，加入對應孔板中(在這一過程中動作輕柔，切忌劇烈震蕩)。以空質粒載體組作為陰性對照。轉染6 h后更換培養基，繼續培養24～48 h，實驗分為陰性對照組、EGFR siRNA-1組、EGFR siRNA-2組和EGFR siRNA-3組，分別采用Realtime RT-PCR和Western blot方法檢測EGFR mRNA和蛋白表達水平來評價3個siRNA的沉默效果。

1.2.4 細胞總RNA提取、逆轉錄及實時熒光PCR

Trizol法提取總RNA，具體步驟見Trizol總RNA抽提試劑盒說明書；逆轉錄SYBR Green及實時熒光PCR步驟見試劑說明書。GAPDH引物序列：上游5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′， 下 游 5′-CCTTC TCCATGGTGGTGAAGAC-3′；EGFR引物序列：上游5′-GTGACCGTTTGGGAGTTGAT-3′， 下 游 5′-GGGC GACTATCTGCGTCTAT-3′；GAPDH作為內參。

1.2.5 Western blot法檢測 利用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，用以檢測EGFR蛋白表達，蛋白濃度測定后，按每孔20μL上樣量用Loading Buffer配平，沸水加熱后上樣，行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺(SDSPAGE)凝膠電泳，轉至硝酸纖維膜。經洗滌后，加入一抗(鼠抗人EGFR抗體1∶1 000稀釋，鼠抗人LC3抗體1∶2 000稀釋，β-actin抗體1∶5 000稀釋)，37℃孵育1h后4℃過夜；PBST洗滌后加入二抗(HRP標記的抗鼠二抗1∶5 000稀釋)。洗滌膜后，利用Easy See化學發光試劑盒孵育發光，顯影。用Image Tool測量目的蛋白條帶盒內參條帶的灰度值，以目的條帶灰度值與內參灰度值的比值作為蛋白的相對表達水平。

1.2.6 沉默EGFR表達后檢測自噬相關蛋白LC3的表達 A549細胞分為4組：EGFR siRNA組，空載體組，轉染試劑組(加入轉染試劑)和空白對照組。4組同時加入等量濃度為50 ng/mL EGF處理24 h后，收集細胞。Western blot方法檢測自噬相關蛋白LC3的表達情況。

1.2.7 透射電子顯微鏡觀察自噬小體 A549細胞分為2組：EGFR siRNA組和空載體組。用配制好2.5%戊二醛固定液固定各組細胞，放入4℃冰箱保存，且無劇烈晃動，固定至少1 h后送電鏡室。用1/15 mol/L的磷酸緩沖液洗滌標本3次，每次約15 min；用1%四氧鋨酸固定標本1～2 h，4℃冰箱保存；用磷酸緩沖液再次洗滌標本3次，每次約15 min；經50%、70%、80%、90%的丙酮濃度梯度脫水，各1次，約15 min，100%丙酮浸入15 min，2次；包埋劑浸透3 h，室溫或過夜：100%丙酮與包埋液比例為1∶1，37℃、60 min；100%丙酮與包埋液比例為1∶3，37℃、過夜；純包埋液浸透37℃、5 h。用環氧樹脂把標本包埋在包埋板或者膠囊中，然后依次置于37℃、24 h；60℃、48 h，進行聚合；用超薄切片機靶標被切成超薄切片，厚約50 nm，接著用醋酸雙氧鈾染色30～45 min，檸檬酸鉛染色5～30 min，透射電子顯微鏡觀察細胞內自噬小體情況。

1.2.8 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行統計學處理，實驗結果用xˉ±s表示，兩組間比較采用t檢驗或Wilcoxon符號秩檢驗，多組間比較采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis H檢驗，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 EGFR蛋白表達水平

在肺腺癌A549細胞中加入不同濃度的EGF，用Western blot法檢測EGFR蛋白的相對表達水平，結果見圖1，可見未處理組和10、25、50 ng/mL EGF處理組的EGFR蛋白相對表達水平分別為0.42±0.02和0.55±0.03、0.94±0.04、4.34±0.16，顯示EGFR蛋白的表達水平隨EGF濃度的增加而升高。

圖1 不同濃度EGF處理肺腺癌A549細胞后EGFR蛋白表達

2.2 特異性EGFR siRNA對EGFR蛋白表達的沉默效應

Western blot檢測結果見圖2，陰性對照組以及轉染EGFR siRNA-1、EGFR siRNA-2、EGFR siRNA-3后，肺腺癌A549細胞EGFR蛋白相對表達水平分別為0.67±0.02、0.30±0.02、0.63±0.07、0.56±0.03。用Real-time RT-PCR法檢測陰性對照組與EGFR siRNA-1組細胞的EGFR mRNA表達水平，結果見圖3，顯示分別為1.06±0.24、0.10±0.01，表明siRNA-1可明顯降低EGFR表達(P均＜0.05)，因此采用EGFR siRNA-1進行后續實驗。

圖2 Western b lot方法檢測siRNA對A549細胞EGFR蛋白表達的沉默效果

圖3 Real-time RT-PCR檢測轉染EGFR siRNA-1后A549細胞EGFR m RNA的表達

2.3 EGFR siRNA對肺腺癌A549細胞的自噬效應分子LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達的影響

Western blot法檢測轉染EGFR siRNA后A549細胞自噬效應分子LC3蛋白表達情況，結果見圖4，顯示轉染EGFR siRNA組細胞自噬相關蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達比例高于其他3組(P＜0.05)；空載體組，轉染試劑組(加入轉染試劑)和空白對照組細胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達比例無明顯差異(P＞0.05)。實驗表明抑制EGFR表達可以提高肺腺癌A549細胞自噬活性。

圖4 Westernblot方法檢測不同處理組A549細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達

2.4 A549細胞經轉染EGFRsiRNA后自噬小體的變化情況

電鏡觀察結果見圖5，在電鏡視野下，自噬小體為雙層或多層膜的球狀結構，內含胞漿成分，如線粒體、內質網、核糖體等。可見相比空載體組，EGFR siRNA組細胞中自噬小體數量顯著增多。可見沉默EGFR基因后，經電鏡直觀顯示A549細胞自噬活性升高。

3 討論

本實驗研究表明，首先，應用特異性EGFR siRNA可以在RNA水平和蛋白水平有效降低表皮生長因子受體EGFR的表達量，成功實現EGFR基因轉錄后沉默效應。其次，在加入表皮生長因子EGF條件下，通過特異性EGFRsiRNA干擾技術降低EGFR表達，實驗通過抑制EGFR表達可以提高肺腺癌A549細胞自噬活性，會誘導自噬活性的增加。WEI[10]等通過EGF刺激及血清饑餓處理兩項條件下已有證實增強EGFR信號通路可以降低細胞自噬的活性。而我們通過應用特異性siRNA干擾技術，逆向證明降低EGFR表達量，可以誘導自噬增加。再次，我們通過透射電子顯微鏡更加直觀的觀察，在加入EGF處理下，EGFRsiRNA轉染入細胞后與對照組相比，細胞內出現大量雙層杯狀膜包裹的細胞內容物的自噬小體。

圖5 透射電子顯微鏡顯示A549細胞超微結構

RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術是非常重要的生物學研究工具，并且在基因治療方面表現出巨大的潛力[11]。研究表明RNAi包括兩個關鍵的部分：siRNA的合成和iRNA與沉默復合物(RISC)結合來介導RISC地靶mRNA的切割，最終誘發放大沉默信號，進而關閉相關的蛋白表達[12-15]。本實驗中應用特異性EGFRsiRNA可以在RNA水平和蛋白水平有效降低表皮生長因子受體EGFR的表達量，成功實現EGFR基因轉錄后沉默效應。

EGFR是一種廣泛分布于機體各組織細胞膜上的多功能跨膜糖蛋白，可與EGF結合形成二聚體發生交聯磷酸化，待激活細胞內TK區后會激活以下信號通路傳導：Ras/MAPK信號通路、PI3K/Akt信號通路、STAT信號通路和Beclin1信號通路[16]。配體EGF對EGFR信號通路內在化作用有明顯的影響。KUMA[17]等研究表明，在不同劑量EGF的誘導會導致EGFR復合物內在化的途徑和效果不同。因此在實驗中選擇不同濃度梯度的EGF，對細胞進行處理，結果顯示隨著EGF濃度升高，EGFR表達呈濃度依賴性升高。

另一方面，細胞自噬是胞漿內長壽蛋白和多余的細胞器通過自噬作用被包裹形成自噬小體，消化降解為氨基酸、脂肪酸等供細胞循環利用，重新合成大分子有機物和ATP，進而維持細胞的正常代謝[18]。自噬相關蛋白LC3可分為三種亞型，其中LC3B亞型與自噬關系最為密切。通常我們對LC3的檢測即對LC3B的檢測。一般情況下，細胞內經轉錄翻譯合成的LC3經過加工，會形成LC3-Ⅰ；當細胞發生自噬時LC3-Ⅰ經泛素樣加工修飾，進而與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結合，便形成LC3-Ⅱ聚集于自噬體膜上，則意味著自噬小體的最終形成，因此，LC3-Ⅱ的含量與自噬泡的數量(即自噬的活性)呈正比[19-20]。細胞自噬與許多疾病的發生有著密切的關系，尤其是自噬作用及自噬因子的調節與腫瘤的發生發展有關。細胞自噬與許多疾病的發生有著密切的關系。自噬可以通過調節腫瘤細胞的微環境的關系來促進腫瘤的生長[21-22]。當腫瘤細胞處于低氧等壓力環境時，缺氧誘導因子1α(hypoxiainducible factor 1α，HIF-1α)和 BCL2/腺病毒EIB19kd結合蛋白(BCL-2/adenovirus EIB 19kdinteracting protein 3，BNIP3)被激活，阻止BCL-2和Beclin1的相互作用，從而激活自噬通路來促進腫瘤細胞對于低氧的應對能力[21-23]。另一方面，自噬對腫瘤也有抑制作用，自噬的異常可導致多種抑癌基因的失活和癌基因的激活，有研究顯示小鼠模型的胰腺細胞經致癌物誘導后，所形成的癌前病灶及腺瘤的自噬能力增加，但當癌細胞形成后自噬活性就會下降[24]。此外，在Braf誘發的肺癌模型以及Atg7沉默的腫瘤模型中會出現脂代謝受損，對于缺乏自噬活性的腫瘤細胞來說，會降低其處理調節營養缺失的能力[25]。由此可見，自噬不僅對細胞正常生理狀態有調節作用，同時也對腫瘤細胞有雙重作用，并且對腫瘤細胞的代謝有調節作用。

綜上所述，在腫瘤細胞中，通過調節EGFR基因表達，經下游信號通路傳導后，最終對自噬活性有明顯的影響，但由于自噬對腫瘤細胞作用較為復雜，需要更深入全面的研究，才能更能明確了解自噬與EGFR信號通路在肺腺癌病理生理機制，進而為肺腺癌臨床治療提供理論基礎。