細(xì)菌瓶法用于反硝化菌菌量的測(cè)定*

易紹金，邢燕青，余 燦

（長(zhǎng)江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北荊州434023）

反硝化菌（denitrifying bacteria，簡(jiǎn)稱DNB）是一群能在厭氧條件下將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽進(jìn)而還原成氮?dú)獾囊活惣?xì)菌的總稱［1-4］。DNB 是重要的微生物采油功能菌［5］，也是抑制硫酸鹽還原菌的重要菌群［6-9］，還是污水生物脫氮的主要菌群［10-11］。因此，在微生物采油、反硝化菌抑制硫酸鹽還原菌科學(xué)研究、菌劑產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)和油田現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控及污水生物脫氮處理等工作過程中，常常需要測(cè)定DNB的數(shù)量（濃度）。

目前，測(cè)定DNB菌量的主要方法是最大概率數(shù)法（MPN 法）。但是，這種方法存在比較明顯的缺陷。首先，該法操作包括清潔玻璃器皿、培養(yǎng)基的配制與滅菌、分裝等一系列過程極為繁瑣、費(fèi)時(shí)；其次，該法在測(cè)定DNB 時(shí)要求在厭氧條件下操作，而實(shí)際過程中易混入氧氣，對(duì)操作條件要求較嚴(yán)。因此，工作效率極低的DNB菌量測(cè)定方法已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代高效工作的需要，研制更加簡(jiǎn)單準(zhǔn)確的DNB菌量測(cè)定的新方法和新工具迫在眉睫。

孫炳德［12］將細(xì)菌測(cè)試瓶法用于硫酸鹽還原菌（SRB）菌量的測(cè)定，認(rèn)為細(xì)菌瓶測(cè)試法在菌量測(cè)定中既簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，又方便快捷。易紹金等［13-15］將細(xì)菌瓶測(cè)試法用于石油烴降解菌、產(chǎn)表面活性劑菌、黃原膠降解菌等相關(guān)細(xì)菌菌量測(cè)定中，進(jìn)一步發(fā)展并完善了細(xì)菌瓶測(cè)試法在相關(guān)細(xì)菌菌量測(cè)定中的應(yīng)用。細(xì)菌瓶?jī)?nèi)裝有SRB等細(xì)菌的專用培養(yǎng)基，只能用于測(cè)定SRB等細(xì)菌，而不能用于測(cè)定DNB。為了更簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的測(cè)定DNB的菌量，根據(jù)細(xì)菌瓶法的基本原理，研制了用于培養(yǎng)DNB的專用測(cè)試瓶。在進(jìn)行了樣品的多次實(shí)際測(cè)試和不斷改良后，現(xiàn)已形成成熟的反硝化菌測(cè)試瓶（DNB-JH型）產(chǎn)品。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

油田產(chǎn)出液，江漢油田；生物抑制菌液、微生物清防蠟菌劑，湖北三雄科技發(fā)展有限公司。STARTER 3100 pH 計(jì)，奧豪斯儀器設(shè)備有限公司；SPX-300BS-Ⅱ生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；AX2202ZH/E電子天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；YM型不銹鋼立式電熱蒸汽消毒器，上海三申醫(yī)療器械有限公司；1.0 mL一次性無菌注射器等。

1.2 DNB測(cè)試瓶的制備

（1）DNB培養(yǎng)液的配制

比較不同配方培養(yǎng)液培養(yǎng)DNB 的速度優(yōu)選培養(yǎng)液配方。反復(fù)篩選得到了以有機(jī)酸鹽為碳源，含有硝酸鹽、磷源和化學(xué)脫氧劑等組分的專門用于培養(yǎng)DNB的培養(yǎng)液配方及其合適的pH值。該配方按照DNB的生理生化特征所設(shè)計(jì)，培養(yǎng)出的細(xì)菌只是在厭氧條件下將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽進(jìn)而還原成氮?dú)獾腄NB，測(cè)試工作不受其他細(xì)菌的干擾。

（2）生長(zhǎng)指示

為了及時(shí)準(zhǔn)確地反映培養(yǎng)液中有無DNB 的生長(zhǎng)，必須確定易于觀察的生長(zhǎng)指示。要求生長(zhǎng)指示特異性強(qiáng)，易于判斷。根據(jù)DNB代謝特點(diǎn)和代謝產(chǎn)物確定其生長(zhǎng)指示。DNB 的生命活動(dòng)會(huì)使培養(yǎng)液產(chǎn)生渾濁，新陳代謝會(huì)產(chǎn)生N2，即培養(yǎng)液變渾變濁并出現(xiàn)肉眼可見的氣泡為DNB的生長(zhǎng)指示。

（3）測(cè)試瓶制備與滅菌

將配制好的培養(yǎng)液厭氧分裝入標(biāo)準(zhǔn)玻璃瓶（15 mL）中，每瓶裝9.0 mL 培養(yǎng)液，然后用橡膠蓋和鋁蓋封口，再按常規(guī)滅菌，即為DNB測(cè)試瓶。

1.3 測(cè)試方法

具體測(cè)定方法按細(xì)菌瓶常規(guī)測(cè)定方法進(jìn)行［13-15］。把接種后的測(cè)試瓶放在30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，無菌生長(zhǎng)的測(cè)試瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液無明顯變化，而有菌生長(zhǎng)的測(cè)試瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液逐漸變渾變濁并出現(xiàn)肉眼可見的氣泡（N2），一般此過程為3數(shù) 5 d，因此確定5 d 讀數(shù)（即樣品注入測(cè)試瓶后培養(yǎng)5 d后的讀數(shù)）。

1.4 計(jì)數(shù)

DNB的測(cè)定一般采用二次平行管測(cè)定方法［16-17］，可根據(jù)表1進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)際樣品測(cè)定時(shí)需乘以稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

為了驗(yàn)證細(xì)菌瓶法測(cè)定的準(zhǔn)確性和可靠性，采用工業(yè)化生產(chǎn)的DNB-JH型測(cè)試瓶對(duì)多個(gè)油田產(chǎn)出液、生物抑制菌液、微生物清防蠟菌劑等樣品中的DNB 數(shù)量進(jìn)行了測(cè)定，并與MPN 法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，選擇具有代表性的3 個(gè)測(cè)定結(jié)果分別列于表2、表3和表4。

表1 二次平行管的細(xì)菌最大可能值

表2 某油田采出液中DNB測(cè)定結(jié)果（二次平行）

表3 某生物抑菌劑中DNB測(cè)定結(jié)果（二次平行）

表4 某微生物清防蠟劑中DNB測(cè)定結(jié)果（二次平行）

由表2數(shù)4 可見，細(xì)菌瓶法的測(cè)定結(jié)果與MPN法基本相同，表明其測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確可靠。而在表3中，可能是由于氧氣的混入導(dǎo)致MPN 法所測(cè)得的DNB 菌數(shù)較細(xì)菌瓶法的低，因此，細(xì)菌瓶法的測(cè)定結(jié)果更為準(zhǔn)確。常見的平板菌落計(jì)數(shù)法不適用于厭氧細(xì)菌菌量的測(cè)定。在測(cè)定厭氧細(xì)菌的菌量時(shí)，MPN法在實(shí)際操作過程中容易混入氧氣，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。而DNB 細(xì)菌瓶法由于在培養(yǎng)液中加入了化學(xué)脫氧劑并采取了隔氧保護(hù)措施，因此在用于DNB菌量的測(cè)定過程中，所培養(yǎng)出的細(xì)菌只是在厭氧條件下將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽進(jìn)而還原成N2的DNB，測(cè)試工作中不會(huì)受氧氣和其他細(xì)菌的干擾。在判斷測(cè)試瓶?jī)?nèi)有無DNB 生長(zhǎng)時(shí)，有DNB 存在的測(cè)試瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液逐漸變渾變濁并出現(xiàn)肉眼可見的氣泡（N2），生長(zhǎng)指示易于觀察，測(cè)定結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

細(xì)菌瓶法可準(zhǔn)確測(cè)定樣品中的反硝化菌的菌量，可用于微生物采油研究、采油菌液產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)（菌量測(cè)定）和微生物采油現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控等。與傳統(tǒng)的MPN 法相比，細(xì)菌瓶法具有生長(zhǎng)指示明顯、操作簡(jiǎn)便和工作效率高等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景良好。