小麥轉錄因子基因TaNAC67參與調控穗長和每穗小穗數

張宏娟 李玉瑩 苗麗麗 王景一 李超男 楊德龍 毛新國,* 景蕊蓮

小麥轉錄因子基因參與調控穗長和每穗小穗數

張宏娟1,2李玉瑩2,3苗麗麗2王景一2李超男2楊德龍1,*毛新國1,2,*景蕊蓮2

1甘肅農業大學生命科學技術學院, 甘肅蘭州 730070;2中國農業科學院作物科學研究所/ 農作物基因資源與基因改良國家重大科學工程/ 農業部農作物種質資源創新與利用重點開放實驗室, 北京 100081;3河南農業大學農學院, 河南鄭州 450002

NAC轉錄因子是植物特有的一類轉錄因子, 在植物生長發育和逆境脅迫應答反應中發揮著重要作用。前期研究表明,參與對多種逆境脅迫的應答, 過量表達能增強擬南芥的抗逆性。為進一步揭示其在調控小麥主要農藝性狀發育方面的作用, 本研究以36份普通小麥組成的高多態性群體為材料, 測序分析了-、-、-序列多態性, 發現-啟動子區–1516 nt有1個A/G轉換SNP, 在–873~ –748 nt處有1個126 bp的InDel;-啟動子區–2014和–1916 nt處各有1個C/T轉換SNP;-啟動子區–1795 nt有1個T/G顛換SNP, 編碼區357 nt處有1個C/T轉換SNP。根據多態性分別開發了功能分子標記, 掃描由282份普通小麥構成的自然群體, 并將基因型和表型性狀檢測結果進行關聯分析,-、-的標記與表型性狀無顯著關聯, 而-的2個標記SNP-D-1和SNP-D-2分別與小麥穗長和每穗小穗數顯著相關。單倍型分析發現, 自然群體中存在3種主要單倍型, 其中-6D-3是增加穗長和每穗小穗數的最優單倍型, 在我國小麥育種歷史中受到了正向選擇。轉基因水稻表型分析發現,過表達能顯著增加水稻主穗穗長、穗分枝和穗粒數, 驗證了小麥關聯分析結果。因此,-可用于改良農作物穗部性狀, 其分子標記可用于小麥分子標記輔助選擇育種。

小麥; 轉錄因子; 單核苷酸多態性; 功能標記; 單倍型; 關聯分析

小麥是世界最主要糧食作物之一。隨著氣候變化, 各種極端天氣事件頻發, 嚴重影響了小麥生產。為確保糧食安全, 迫切需要培育抗逆、穩產、廣適小麥新品種, 而挖掘利用小麥自身優異遺傳資源是解決這一問題的最經濟有效途徑。NAC (NAM、ATAF和CUC)轉錄因子是植物特有的一類轉錄因子, 它不僅在植物生長發育過程中起重要作用, 而且還參與對高鹽、低溫、低氧和干旱等多種非生物脅迫的響應[1-3]。NAC轉錄因子家族成員N端包含一個高度保守、特征性的DNA結合結構域, 即NAC結構域, 而C端轉錄激活結構域高度多樣化[4-6]。NAC家族成員廣泛存在于多種植物中[7], 其最早在矮牽牛中被發現[8], 隨后相繼在擬南芥、水稻、玉米、小麥、棉花、大豆等作物中被報道。

NAC轉錄因子參與調節根系發育, 如參與調控器官發生, 促進根尖出現[9];參與調控根系構型, 其過表達能改良水稻根系結構, 提高籽粒產量[10];過表達能增加轉基因水稻的穗數和灌漿速率[11];在根系中的過表達能夠增加水稻的小穗數[12]; 過表達能顯著增加擬南芥側根數量[13];過表達不僅可增加小麥根系長度和生物量, 還能提高抗旱性和水分虧缺條件下籽粒產量[14];過表達能促進小麥根系伸長, 增加轉基因小麥的生物量[15]。NAC還參與調控葉片衰老, 如、、等過表達促進擬南芥葉片早衰[16-18];過表達導致轉基因水稻抽穗提前, 葉片衰老加速[19]; 大麥中過表達導致發育延遲, 并伴隨早衰[20]。

NAC參與對多種生物脅迫的應答。如受馬鈴薯病原菌感染和損傷誘導表達[21]; 小麥受條銹病菌侵染誘導表達[22];負調控小麥條銹病抗性[23];表達受稻瘟病誘導, 其過表達可增強植物防御反應[24];正調控水稻對稻瘟病和細菌性枯萎病的抗性, 其過表達可提高轉基因水稻的抗病性[25]。

NAC在植物非生物逆境脅迫應答反應中發揮重要作用。如水稻、、、和等受低溫、干旱和高鹽度等多種非生物脅迫誘導[6,10,26-28], 過表達促進鹽誘導的細胞程序性死亡[26]。玉米過表達能增強擬南芥的耐旱性和耐鹽性, 提高存活率[29];受干旱、高鹽度和冷脅迫以及脫落酸(ABA)誘導[30]。小麥、和均受多種逆境脅迫誘導表達, 過量表達能顯著增強轉基因植物對多種逆境的抗性[1,31-32]。本課題組前期研究發現,參與對多種逆境脅迫的應答, 其過量表達能顯著提高轉基因擬南芥對多種逆境的抗性[33], 但有關是否參與調控植物的生長發育, 尤其是否參與調控重要農藝性狀, 未見報道。

本研究通過測序發掘-、-、-等多態性位點, 開發功能分子標記, 掃描自然群體, 通過關聯分析揭示多態性位點與農藝性狀的關系, 發掘優異單倍型, 為小麥分子育種提供分子標記和優異基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及其培養條件

試驗材料由中國農業科學院作物科學研究所小麥基因資源與種質創新重點實驗室提供?；蚨鄳B性分析群體由36份多態性較高的普通小麥組成, 該群體是用209對SSR引物對262份材料進行多態性分析后篩選出來的; 農藝性狀分析群體(PA)包含了282份來自我國黃淮和北方冬麥區的普通小麥; 單倍型地理分布分析材料包括157份農家品種組成的群體(PL)和348份現代育成品種組成的群體(PM)。挑取飽滿的種子放于培養皿中, 在人工氣候室內水培至一葉一心, 取葉片提取DNA。

PA于2010—2013、2015—2017年種植于中國農業科學院作物科學研究所順義和昌平試驗基地, 其中2010—2012、2015年僅在順義基地種植, 2013年只種在昌平基地種植, 田間水分管理分為雨養/干旱脅迫、灌溉2種條件, 共有30個環境(年份×地點×水分×熱脅迫)的表型數據。雨養/干旱脅迫是指在小麥的整個生長季節不給予任何人工灌溉, 完全由雨水滋養生長; 灌溉是指在越冬前、孕穗期、開花期和灌漿期根據土壤墑情適時灌溉(750 m3hm–2); 熱脅迫是指在抽穗期通過覆蓋塑料膜創造高溫脅迫環境。7個小麥生長季(2010、2011、2012、2013、2015、2016和2017年)的降雨量依次為131、180、158、163、173、143和116 mm。每份材料均勻點播在行長2 m、間距0.3 m的4行小區, 每行點播40粒種子。收獲時從每個小區中隨機取5株, 考察穗長、每穗小穗數、穗粒數、株高、穗下節長和千粒重等農藝性狀。

1.2 TaNAC67序列單核苷酸多態性分析

根據克隆的-、-、-基因組序列, 利用Primer Premier 5.0軟件設計基因組特異引物NAC67-6AsF/R、NAC67-6BsF/R和NAC67-6DsF/R (表1), 分別擴增A、B、D基因組全長序列。以多態性分析群體基因組DNA為模板, 用高保真DNA聚合酶TransStart FastPfu進行PCR擴增。PCR體系包括5 × TransStart FastPfubuffer 6 μL, 2.5 mmol L–1dNTPs 2.4 μL, TransStart FastPfu DNA Polymerase 0.6 μL, 正、反向引物(10 μmol L–1)各1.5 μL, 50 ng μL–1模板DNA 2 μL, 用ddH2O補至30 μL。PCR擴增程序為95℃ 5 min; 95℃ 1 min, 55~60℃ 45 s, 72℃ 3 min, 35個循環; 72℃, 10 min。用1.2%瓊脂糖凝膠分離PCR產物, 目的片段經回收純化后, 連接pEASY-Blunt zero載體, 挑單克隆, 提取質粒測序。

表1 試驗中使用的引物

根據-、-、-序列信息, 設計基因組特異測序引物(表1), 用DNA Analyzer 3730測序。用DNASTAR Lasergene 7.1軟件包中的Seqman軟件進行序列拼接、組裝, 用MegAlign軟件進行序列多態性分析。

1.3 分子標記開發

在-啟動子區發現了1個SNP和1個126 bp的InDel, 即A-1516 (A/G)和A-126。在A-1516多態性位點設計含有內切酶I酶切位點(TGC▼GCA)的CAPS特異引物A-1516-F/R, 在A-126 bp (–873~ –748 nt) InDel附近設計特異擴增引物A-126-F/R, 進行PCR擴增(表1)。

在-啟動子區檢測到2個SNP, B-2014 (C/T)和B-1916(C/T), 分別設計了dCAPS分子標記。在B-2014 (C/T)前引入2個錯配堿基TG, 形成能被I切開的酶切位點(CTGCA▼G); 在B-1916 (C/T)前引入一個錯配堿基T, 使序列中含有I酶切位點(G▼CTAGC)。位點特異引物分別為B-1916-F/R和B-2014-F/R (表1)。

在-啟動子區和編碼區各檢測到1個SNP, D-1795 (T/G)和D357 (C/T)。在D-1795位點設計CAPS特異引物D-1795-F/R (表1), 使序列中含有內切酶Ⅲ酶切位點(GG▼CC)。在D357差異堿基前5 nt處引入錯配堿基G, 使序列中含有I的酶切位點(G▼TCGAC), 特異引物為D357-F/R (表1)。

以小麥基因組DNA為模板, 利用基因組特異引物NAC67AsF/R、NAC67BsF/R和NAC67DsF/R分別擴增得到第1輪PCR產物。將第1輪PCR產物稀釋100倍, 取2 μL作模板進行二次擴增。反應體系為2× Utaq mix 10 μL, 正、反向引物(10 μmol L–1)各1 μL, 用ddH2O補至20 μL。-的2個SNP位點二輪PCR程序均為95℃ 5 min; 95℃ 1 min, 65℃ 30 s, 72℃ 30 s, 32個循環; 72℃ 10 min。的2個SNP位點二輪PCR程序均為95℃ 5 min; 95℃ 1 min, 61℃ 30 s, 72℃ 30 s, 32個循環; 72℃ 10 min; D-1795多態性位點二輪PCR程序與B基因組SNP位點二輪PCR程序相同。D357多態性位點的第二輪PCR程序為95℃ 5 min; 95℃ 1 min, 64℃ 30 s, 72℃ 30 s, 32個循環; 72℃ 10 min。取4 μL二輪PCR產物用對應限制性內切酶消化, 用5%瓊脂糖凝膠電泳分離,根據酶切后片段大小統計分析不同材料基因型。

1.4 關聯分析

利用開發的分子標記, 對農藝性狀分析群體PA進行基因型掃描, 發現存在4種單倍型。運用TASSEL (version 5.2.51)軟件的一般線性模型GLM (general liner model), 把群體結構(Q)作為協變量, 將-、-、-的基因型和表型性狀進行關聯分析。用SPSS (version 19.0)軟件進行方差分析, 檢測不同基因型/單倍型性狀差異的顯著性。

1.5 轉基因水稻農藝性狀測定

為進一步解析在作物生長發育中的功能, 將全長ORF克隆到雙元表達載體pCAMBIA1390上, 用電擊法轉導農桿菌EHA105, 及農桿菌介導法轉化水稻(Kitaake)。用PCR方法檢測T0代轉基因水稻, 并通過測序確定陽性植株。收獲T0代轉基因水稻種子, 在萌發期通過潮霉素抗性篩選轉基因后代, 得到T1代轉基因植株。在萌發期對T1代轉基因種子進行潮霉素篩選, 根據根系生長情況, 判斷T2代植株的分離比例, 篩選后代分離比符合3﹕1的株系進行加代, 再經潮霉素抗性篩選后得到T3代純合轉基因株系。

將大小一致的水稻種子置培養皿中, 在光照培養箱中水培3~4 d, 挑選發芽一致的種子種在裝有草碳土的育苗盤中, 待長至4~5葉時, 將長勢一致的幼苗移栽到大小相同、裝有相同體積腐殖土的塑料盒中(70 cm × 38 cm × 40 cm), 每盒18株, 轉基因株系后期水肥管理和野生型對照完全一致。在成熟期測定株高, 主穗長、穗分枝和穗粒數。用自動考種儀(萬深SC-G)測量千粒重、粒長、粒寬, 用SPSS軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 TaNAC67序列多態性

在六倍體普通小麥中克隆了的3種基因組序列, 基因結構分析發現沒有內含子, 序列比對表明它們分別來自小麥6A、6B和6D染色體,因此命名為-、-、-。-序列全長3484 bp, 包括啟動子區2453 bp和編碼區1031 bp;-序列全長3431 bp, 其中啟動子區2560 bp, 編碼區871 bp;-序列全長3843 bp, 其中啟動子長2763 bp, 編碼區1080 bp。通過對36份高多態性普通小麥測序, 在-啟動子區–1516 nt處有1個G/A轉換SNP, 在–873~ –748 nt處有一個126 bp的InDel (圖1-A)。在-啟動子–2014和–1916 nt處存在2個C/T轉換SNP (圖2-A)。在-啟動子–1795 nt和編碼區357 nt處各檢測到1個SNP, 分別是T/G顛換和C/T轉換(圖3-A)。

圖1 TaNAC67-6A序列多態性(A)及等位特異標記SNP-A-1 (B)和CAPS標記SNP-A-2 (C)

圖C: 當–1516 nt基因型為A時不能被酶切, 當基因型為G時能夠被酶切。M: 100 bp DNA ladder。

Fig. C: if the nucleotide at –1516 nt is A, the PCR product cannot be digested; if it is G, the PCR products can be digested. M: 100 bp DNA ladder.

2.2 TaNAC67-6A、TaNAC67-6B、TaNAC67-6D分子標記開發

根據-啟動子區2個多態性位點, 開發了1個等位特異標記和1個CAPS標記, SNP-A-1和SNP-A-2。根據–1516 nt處G-A轉換的差異, 設計含有內切酶I酶切位點(TGC▼GCA)的特異擴增引物。若–1516 nt處是A, 則PCR產物上沒有酶切位點, 因此經I消化處理后瓊脂糖凝膠電泳只有303 bp的單一條帶; 若–1516 nt為G, 則PCR產物經I消化后產生273 bp和30 bp兩條帶(圖1-C)。在A-126 nt (–873~ –748 nt)附近設計特異擴增引物A-126-F/R進行PCR擴增, 若有插入則PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后是490 bp單一條帶, 用+表示; 若沒有126 nt的片段插入, PCR產物只有一條364 bp的條帶,用“–”表示(圖1-B)。在PA群體中, –1516 nt處基因型A占33.33%, 基因型G占66.67%; 在InDel位點, 有插入片段的基因型占5.71%, 沒有插入片段的占94.29%。

在啟動子區檢測到2個多態性位點, –2014 nt (C/T)和–1916 nt (C/T), 分別開發了dCAPS分子標記SNP-B-1和SNP-B-2。通過引入錯配堿基, 分別設計含有內切酶I (CTGCA▼G)和I (G▼CTAGC)的特異擴增引物B-2014-F/R和B-1916- F/R (表1)。若–2014 nt處基因型為C, PCR產物能被酶切, 產生294和25 bp兩條帶; 若–2014 nt處基因型為T, PCR產物不含I酶切位點, 因此電泳后只能看到319 bp單一條帶(圖2-B)。若–1916 nt基因型是C, PCR產物含有I酶切位點, 能夠被酶切, 產生209 bp和23 bp兩條帶; 若在–1916 nt處是T, PCR產物不含酶切位點, 電泳僅檢測到232 bp單一條帶(圖2-C)。PA群體在–2014 nt處基因型C占81.69%, 基因型T占18.31%; 在–1916 nt處, 基因型C占96.43%, 基因型T占3.57%。

根據-啟動子和編碼區的2個SNP位點分別開發CAPS標記SNP-D-1和dCAPS標記SNP- D-2。SNP-D-1所在位點是G-T顛換差異, 直接設計含有內切酶III (GG▼CC)的特異引物D-1795-F/R (表1)。若–1795 nt處是堿基T, 則PCR產物不含III酶切位點(GG▼CC), 不能被酶切, 電泳結果為308 bp單一條帶; 若是堿基G, PCR產物含有酶切位點, 經III消化處理后, 電泳結果為276 bp和32 bp兩條帶(圖3-B)。SNP-D-2所在位點是C-T轉換差異, 引入錯配堿基, 設計有內切酶I (G▼TCGAC)酶切位點的特異引物D357-F/R (表1)。若357 nt處堿基是T, PCR結果不含I (G▼TCGAC)酶切位點, 不能被酶切, 電泳顯示為216 bp單一條帶; 若357 nt處差異堿基是C, 能夠被I酶切, 電泳結果顯示為200 bp和16 bp兩條帶(圖3-C)。PA群體在–1795 nt處, 基因型G占75.54%, 基因型T占24.46%; 在357 nt處, 基因型T占14.18%; 基因型C占85.82%。

圖2 TaNAC67-6B基因序列多態性(A)以及dCAPS標記SNP-B-1 (B)和SNP-B-2 (C)

圖B: 當–2014 nt基因型為C時能被酶切, 當基因型為T時不能被酶切; 圖C: 當–1916 nt基因型為T時不能被酶切, 當基因型為C時能被酶切。M: 100 bp DNA ladder。

Fig. B: if the genotype at –2014 nt is C the PCR products can be digested; if it is T the PCR products cannot be digested. Fig. C: if the genotype at–1916 nt is T, the PCR products cannot be digested, if it is C the PCR products can be digested. M: 100 bp DNA ladder.

圖3 TaNAC67-6D序列多態性(A)以及CAPS標記SNP-D-1 (B)和dCAPS標記SNP-D-2 (C)

圖B: 當–1795 nt基因型是G時能被酶切, 當基因型為T時不能被酶切; 圖C: 當357 nt基因型是T時不能被酶切, 當基因型是C時能被酶切。M: 100 bp DNA ladder。

Fig. B: if the genotype at –1795 nt is G, the PCR products can be digested; if it is T the PCR products cannot be digested. Fig. C: if the genotype at 357 nt is T the PCR products cannot be digested, if it is C the PCR products can be digested. M: 100 bp DNA ladder.

2.3 功能標記與農藝性狀的關聯分析

用的分子標記SNP-A-1、SNP-A-2、SNP-B-1、SNP-B-2、SNP-D-1和SNP-D-2對PA進行基因型掃描, 對PA在7個年點, 30種環境下的表型性狀進行關聯分析。結果顯示, 只有來自-的標記SNP-D-1和SNP-D-2分別與穗長和每穗小穗數有顯著關聯(表2), 其余標記與表型性狀之間無顯著關聯。

表2 TaNAC67-6D標記SNP-D-1、SNP-D-2與農藝性狀相關性

SY: 順義; CP: 昌平; DS: 旱處理; HS: 熱處理; WW: 正常灌溉; SL: 穗長; TNSS: 每穗小穗數。n.s., 未達到-value為0.05的顯著水平;*、**、***分別表示在0.05、0.01、0.001概率水平差異顯著。

SY: Shunyi; CP: Changping; DS: drought stress; HS: heat stress; WW: well-watered; SL: spike length; TNSS: total number of spikelet per spike. n.s., not significant;*,**,***represent significant at the 0.05, 0.01, 0.001 probability levels, respectively.

關聯分析表明, 標記SNP-D-1在30種環境條件下, 即9種水地、9種旱地、6種水熱和6種旱熱環境條件下, 均與穗長(spike length, SL)呈顯著或極顯著相關。標記SNP-D-2在20種環境條件下, 即7種水地、7種旱地、3種水熱和3種旱熱環境下, 與每穗小穗數(total number spikelet per spike, TNSS)呈顯著或極顯著相關(表2)。統計結果顯示, 在PA群體中, 標記SNP-D-1位點基因型是T的材料穗長顯著或極顯著高于基因型為G的材料(圖4-A), 標記SNP-D-2位點基因型為C的材料每穗小穗數顯著或極顯著高于基因型是T的材料(圖4-B)。因此推測, 標記SNP-D-1-T是增加穗長的優異等位變異, 標記SNP-D-2-C是增加每穗小穗數的優異等位變異。

圖4 30種環境下標記SNP-D-1和SNP-D-2兩種基因型的表型比較

30種環境條件下標記SNP-D-1 (A)和SNP-D-2 (B)兩種基因型穗長(A)和每穗小穗數(B)比較。*、**、***分別表示在0.05、0.01、0.001概率水平差異顯著。

Comparisons of spike length (A) and total number of spikelet per spike (B) for two genotypes of SNP-D-1 (A) and SNP-D-2 (B) under 30 environmental conditions. *, **, *** represent significant at the 0.05, 0.01, 0.001 probability levels, respectively.

2.4 TaNAC67-6D單倍型與農藝性狀的關系

標記掃描發現, 在PA群體中存在4種單倍型, 即-6D-1、-6D-2、-6D-3和-6D-4 (圖3-A), 其所占比例分別是12.13%、63.24%、22.43%和2.21%。由于-6D-4所占比例小于5%, 為稀有單倍型, 因此在后續分析中不再考慮。統計分析發現, 除E2環境條件外, 29種環境條件下單倍型為-6D-3材料穗長均顯著高于-6D-2的穗長; 在9種環境條件下(E6-E10、E13、E16、E27、E29),-6D-3的穗長顯著高于-6D-1 (圖5-A)。在18種環境條件下(E2-E4、E7-E13、E15-E17、E22、E25-E27、E29),-6D-3的每穗小穗數顯著高于-6D-1, 而-6D-3與-6D-2之間沒有顯著差異(圖5-B)。綜上所述,-6D-3既能增加小麥穗長, 又能增加每穗小穗數, 因此是控制穗長和每穗小穗數的優異單倍型。

2.5 TaNAC67-6D單倍型在我國十大麥區的地理分布

根據地域氣候特征、地勢地形、栽培特點和播種、成熟期早晚等, 我國的小麥種植區劃分為10個主要生態區域, 即北部冬麥區、黃淮冬麥區、長江中下游冬麥區、西南冬麥區、華南冬麥區、東北春麥區、北部春麥區、西北春麥區、青藏春-冬麥區和新疆冬-春麥區[34]。為了研究-三種單倍型在我國十大麥區的分布特點, 分別分析了農家品種群體(PL)和育成品種群體(PM)材料的單倍型。在PL中僅檢測到兩種單倍型, 即-6D-2和-6D-3。在黃淮冬麥區(II)、西北春麥區(VIII)、青藏春-冬麥區(IX)和西南冬麥區(IV)等4個麥區農家品種中只檢測到-6D-2; 在其他6個麥區中-6D-2比例也均超過80%, 因此在農家品種中,-6D-2是優勢單倍型(圖6-A)。在PM中存在3種單倍型, 但是在青藏春-冬麥區(IX)中只檢測到-6D-2, 在西南冬麥區(IV)和華南冬麥區(V)檢測到-6D-2和-6D-3兩種單倍型。與PL相比,-6D-3在PM的比例明顯增加, 其中西南冬麥區(IV)中單倍型-6D-3從0增加到7.89%, 華南冬麥區(V)中從16.67%增加到28.57%。在其余的7個麥區中均存在3種單倍型, 其中-6D-1在東北春麥區(VI)和新疆冬-春麥區(X)兩大麥區中比例顯著上升, 分別從無各增加了20%和11.11%。在北部冬麥區(I)、北部春麥區(VII)、黃淮冬麥區(II)和長江中下游冬麥區(III),-6D-3的頻率也呈明顯上升趨勢。由圖6可以看出, 從農家品種到現代育成種,-6D-1和-6D-3的頻率呈上升趨勢, 說明這兩種單倍型在育種中受到了選擇。

圖5 30種環境條件下TaNAC67-6D三種單倍型表型比較

在30種環境條件下3種單倍型穗長(A)和每穗小穗數(B)比較。不同的小寫字母表示0.05水平下差異的顯著性。

Comparisons of spike length (A) and total number of spikelet per spike (B) for three haplotypes ofunder 30 environments. Bars superscripted by different letters are significantly different at the 0.05 probability level.

圖6 TaNAC67-6D單倍型在我國十大麥區的地理分布

-三個單倍型在我國十大麥區農家品種(A)和育成品種(B)群體中的分布。I: 北方冬麥區; II: 黃淮冬麥區; III: 長江中下游冬麥區; IV: 西南冬麥區; V: 南方冬麥區; VI: 東北春麥區; VII: 北方春麥區; VIII: 西北春麥區; IX: 青-藏冬春麥區; X: 新疆冬春麥區。

Haplotype distributions of-in landrace (A) and modern variety (B) populations. I: Northern Winter Wheat Zone; II: Yellow and Huai River Valleys Facultative Wheat Zone; III: Middle and Low Yangtze Valleys Autumn-Sown Spring Wheat Zone; IV: Southwestern Autumn-Sown Spring Wheat Zone; V: Southern Autumn-Sown Spring Wheat Zone; VI: Northeastern Spring Wheat Zone; VII: Northern Spring Wheat Zone; VIII: Northwestern Spring Wheat Zone; IX: Qinghai-Tibetan Plateau Spring-Winter Wheat Zone; X: Xinjiang Winter-Spring Wheat Zone.

2.6 轉基因水稻穗部表型及其與關聯分析結果的關系

對野生型和過表達轉基因水稻株系(L1和L2)成熟期穗部性狀測定分析發現, 轉基因水稻主穗長顯著大于野生型對照(圖7-A, B)。同時轉基因水稻主穗的一級分枝和二級分枝(圖7-C)、主穗穗粒數(圖7-D)均顯著高于野生型, 雖然秕粒數也顯著高于野生型(圖7-E), 但最終飽滿籽粒數仍顯著高于野生型對照; 轉基因水稻的千粒重與野生型之間沒有顯著差異(圖7-F)。

3 討論

NAC轉錄因子超家族是植物特有的轉錄因子超家族, 在植物體廣泛存在。在玉米[35]、水稻[7]、馬鈴薯[36]、小麥[37]等均超過100個成員, 在植物的生長發育和逆境脅迫應答方面發揮著極其重要的作用。前人研究發現, 過表達能改變水稻根系結構, 并提高籽粒產量[10];和激活細胞程序性死亡相關基因表達, 誘導細胞死亡[38];參與抑制水稻開花[39]。、-過表達不僅可增加小麥根長, 還提高產量或生物量[14-15]。本研究采用關聯分析方法, 發現參與控制小麥的穗長和每穗小穗數, 并通過轉化水稻進一步證明上述結果, 說明在控制重要農藝性狀發育方面發揮重要作用。

圖7 轉基因水稻穗部性狀比較

轉基因水稻穗部特征(A)及轉基因水稻(L1、L2)與野生型(WT)主穗的穗長(B)、穗分枝(C)、千粒重(TGW)(D)、穗粒數(E)和空粒數(F)比較。**表示在0.01概率水平差異顯著。

Comparisons of panicle traits between transgenic rice (L1, L2) and WT in panicle phenotype (A), panicle length (B), panicle branch (C), grain number per panicle (D), sterile grain number per panicle (E), and thousand grain weight (TGW) (F). ** Significant at the 0.01 probability level.

本研究克隆了包括上游啟動子區和基因編碼區的基因組序列-、-、-, 并通過直接測序檢測其DNA序列多態性, 發現的3個拷貝均存在序列多態性, 其中-、-多態性位點均位于啟動子區, 而-啟動子區和編碼區均存在SNP。關聯分析發現-、-的4個標記SNP-A-1、SNP-A-2、SNP-B-1、SNP-B-2與所檢測的農藝性狀沒有顯著關聯, 推測雖然這些變異位于啟動子區, 但其對基因的表達可能影響不大, 因此與考察的性狀沒有顯著關聯, 后期還需要對此進一步深入研究。位于-編碼區357 nt的SNP位點正好處于密碼子的第3位, 其2種基因型均未導致氨基酸變異, 屬于典型的同義突變, 說明在結構上很保守, 也暗示了其功能的重要性。

有研究發現,過表達能增加轉基因水稻的穗數, 同時提高灌漿速率[11],過表達能夠增加水稻小穗數[12]。我們通過關聯分析發現,-的2個SNP位點分別與穗長和每穗小穗數顯著相關, 而轉基因結果表明過表達能增加水稻的穗長和穗分枝數, 同時穗粒數也有顯著提高, 進一步驗證了關聯分析結果, 這一方面說明NAC轉錄因子參與調控小麥、水稻等農作物的穗部性狀, 另一方面也說明-的2個功能標記可以用于穗部性狀的選擇。在PA中共檢測到4種單倍型, 其中-6D-4為稀有單倍型, 未做進一步分析。對前3種單倍型材料的方差分析發現, 不同單倍型材料的穗長變化趨勢明顯, 即-6D-3＞-6D-1＞-6D-2, 且不同單倍型每穗小穗數變化趨勢與穗長分析結果基本吻合, 因此認為-6D-3是增加穗長和穗粒數的最優單倍型。從3種單倍型在我國十大麥區的地理分布來看,-6D-2在黃淮冬麥區(II)、西北春麥區(VIII)、青藏春-冬麥區(IX)和西南冬麥區(IV) 農家品種中為主要單倍型, 所占比例達到了100%, 同時在其他幾個麥區的比例也超過了80% (圖6-A), 從一個側面反映了-6D-1和- 6D-3可能是比較新的單倍型。在現代育成品種中, 除育種工作較弱的青藏春冬麥區(IX)外, 其他各區均檢出-6D-1和/或-6D-3, 同時二者所占的比例也較農家品種有所提升(圖6-B), 說明二者在我國小麥育種中受到了正向選擇。

比較-6D-1和-6D-3, 二者對穗長和穗粒數均有正向貢獻, 但是-6D-3的貢獻更大。與此一致, 在絕大多數麥區的育成品種中-6D-3所占的比例也相對較大, 這在一定程度上反映了育種家對大穗多粒性狀的關注。不過, 最優單倍型-6D-3在各大麥區中所占的比例仍然較低, 因此還有很大的提升利用空間。轉基因水稻的表型也驗證了小麥關聯分析的結果。因此認為可以用于改良穗部性狀, 本研究開發的-分子標記可用于小麥分子標記輔助選擇育種。

4 結論

小麥基因-、-、-的多態性多數位于啟動子區, 其編碼區相對保守。在小麥自然群體中,-存在3種主要單倍型, 其中-6D-3是增加穗長和穗粒數的優異單倍型, 在我國小麥育種中受到了正向選擇?？梢杂糜诟牧嫁r作物的穗部性狀, 其功能標記SNP-D-1和SNP-D-2將有利于小麥分子標記輔助選擇育種。

[1] Huang Q, Wang Y, Li B, Chang J, Chen M, Li K, Yang G, He G. TaNAC29, a NAC transcription factor from wheat, enhances salt and drought tolerance in transgenic., 2015, 15: 268.

[2] Jin C, Li K Q, Xu X Y, Zhang H P, Chen H X, Chen Y H, Hao J, Wang Y, Huang X S, Zhang S L. A novel NAC transcription factor, PbeNAC1, ofconfers cold and drought tole-rance via interacting with PbeDREBs and activating the expression of stress-responsive genes., 2017, 8: 1049.

[3] Hu H, You J, Fang Y, Zhu X, Qi Z, Xiong L. Characterization of transcription factor geneconferring cold and salt tolerance in rice., 2010, 72: 567–568.

[4] Aida M, Ishida T, Fukaki H, Fujisawa H, Tasaka M. Genes involved in organ separation in: an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant., 1997, 9: 841–857.

[5] Taoka K, Yanagimoto Y, Daimon Y, Hibara K, Aida M, Tasaka M. The NAC domain mediates functional specificity of cup-shaped cotyledon proteins., 2004, 40: 462.

[6] Nakashima K, Tran L S, Van Nguyen D, Fujita M, Maruyama K, Todaka D, Ito Y, Hayashi N, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. Functional analysis of a NAC-type transcription factor OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress-responsive gene expression in rice., 2007, 51: 617–630.

[7] Nuruzzaman M, Manimekalai R, Sharoni A M, Satoh K, Kondoh H, Ooka H, Kikuchi S. Genome-wide analysis of NAC transcription factor family in rice., 2010, 465: 30–44.

[8] Souer E, van Houwelingen Adèle, Kloos D, Mol J, Koes R. Kloos The no apical meristem gene of Petunia is required for pattern formation in embryos and flowers and is expressed at meristem and primordia boundaries., 1996, 85: 159–170.

[9] Chen X, Cheng J, Chen L, Zhang G, Huang H, Zhang Y, Xu L. Auxin-independent NAC pathway acts in response to explant- specific wounding and promotes root tip emergence during de novo root organogenesis in., 2016, 170: 2136–2145.

[10] Redillas M C, Jeong J S, Kim Y S, Jung H, Bang S W, Choi Y D, Ha S H, Reuzeau C, Kim J K. The overexpression ofalters the root architecture of rice plants enhancing drought resistance and grain yield under field conditions., 2012, 10: 792–805.

[11] Shim J S, Oh N, Chung P J, Kim Y S, Choi Y D, Kim J K. Overexpression ofimproves drought tolerance in rice., 2018, 9: 310.

[12] Lee D K, Chung P J, Jeong J S, Jang G, Bang S W, Jung H, Kim Y S, Ha S H, Choi Y D, Kim J K. The rice OsNAC6 transcription factor orchestrates multiple molecular mechanisms involving root structural adaptions and nicotianamine biosynthesis for drought tolerance., 2017, 15: 754–764.

[13] Li J, Guo G H, Guo W W, Guo G G, Tong D, Ni Z F, Sun Q X, Yao Y Y. miRNA164-directed cleavage of ZmNAC1 confers lateral root development in maize (L.)., 2012, 12: 220.

[14] Chen D D, Chai S C, Mcintyre C L, Xue G P. Overexpression of a predominantly root-expressed NAC transcription factor in wheat roots enhances root length, biomass and drought tolerance., 2018, 37: 225–237.

[15] Chen D, Richardson T, Chai S, Lynne Mcintyre C, Rae A L, Xue G P. Drought-up-regulated TaNAC69-1 is a transcriptional re-pressor ofand, and enhances root length and biomass in wheat., 2016, 57: 2076–2090.

[16] Li W, Li X X, Chao J T, Zhang Z L, Wang W F, Guo Y F. NAC family transcription factors in tobacco and their potential role in regulating leaf senescence., 2018, 9: 1900

[17] Zhao F L, Ma J H, Li L B, Fan S L, Guo Y N, Song M Z, Wei H L, Pang C Y, Yu S X., a neutral candidate gene, leads to early aging in cotton (L.)., 2015, 576: 268–274.

[18] Ren T T, Wang J W, Zhao M M, Gong X M, Wang S X, Wang G, Zhou C J. Involvement of NAC transcription factor SiNAC1 in a positive feedback loop via ABA biosynthesis and leaf senescence in foxtail millet., 2017, 247: 1–16.

[19] El Mannai Y, Akabane K, Hiratsu K, Satoh-Nagasawa N, Wabiko H. The NAC transcription factor gene() promotes leaf senescence and accelerates heading time in rice., 2017, 18: 2165.

[20] Christiansen M W, Matthewman C, Podzimska-Sroka D, O’Shea C, Lindemose S, Mollegaard N E, Holme I B, Hebelstrup K, Skriver K, Gregersen P L. Barley plants over-expressing the NAC transcription factor geneshow stunting and delay in development combined with early senescence., 2016, 67: 5259–5273.

[21] Collinge M, Boller T. Differential induction of two potato genes,and, in response to infection by Phytophthora infestans and to wounding., 2001, 46: 521–529.

[22] Xia N, Zhang G, Liu X Y, Deng L, Cai G L, Zhang Y, Wang X J, Zhao J, Huang L L, Kang Z S. Characterization of a novel wheat NAC transcription factor gene involved in defense response against stripe rust pathogen infection and abiotic stresses., 2010, 37: 3703–3712.

[23] Wang B, Wei J, Song N, Wang N, Zhao J, Kang Z S. A novel wheat NAC transcription factor, TaNAC30, negatively regulates resistance of wheat to stripe rust., 2018, 60: 432–443.

[24] Wang Z, Xia Y, Lin S, Wang Y, Guo B, Song X, Ding S, Zheng L, Feng R, Chen S, Bao Y, Sheng C, Zhang X, Wu J, Niu D, Jin H, Zhao H. Osa-miR164a targetsand negatively regulates rice immunity against the blast fungus., 2018, 95: 584–597.

[25] Liu Q, Yan S J, Huang W J, Yang J Y, Dong J F, Zhang S H, Zhao J L, Yang T F, Mao X X, Zhu X Y. NAC transcription factor ONAC066 positively regulates disease resistance by suppressing the ABA signaling pathway in rice., 2018, 98: 289–302.

[26] Mao C, Ding J, Zhang B, Xi D, Ming F. OsNAC2 positively affects salt-induced cell death and binds to theandpromoters., 2018, 94: 454–468.

[27] Shen J, Lü B, Luo L, He J, Mao C, Xi D, Ming F. The NAC-type transcription factor OsNAC2 regulates ABA-dependent genes and abiotic stress tolerance in rice., 2017, 7: 40641.

[28] Chung P J, Jung H, Choi Y D, Kim J K. Genome-wide analyses of direct target genes of four rice NAC-domain transcription factors involved in drought tolerance., 2018, 19: 40.

[29] 盧敏, 張登峰, 石云素, 宋燕春, 黎裕, 王天宇. 玉米脅迫誘導表達基因的功能分析. 作物學報, 2013, 39: 2177–2182.Lu M, Zhang D F, Shi Y S, Song Y C, Li Y, Wang T Y. Overexpression of a stress induced maize NAC transcription factor gene,, improved drought and salt tolerance in., 2013, 39: 2177–2182 (in Chinese with English abstract).

[30] Mao H, Yu L, Han R, Li Z, Liu H. ZmNAC55, a maize stress-responsive NAC transcription factor, confers drought resistance in transgenic., 2016, 105: 55–66.

[31] Xia N, Zhang G, Yan F, Zhu L, Xu L S, Chen X M, Liu B O., a novel NAC transcription factor gene in wheat, responds to stripe rust pathogen infection and abiotic stresses., 2010, 74: 394–402.

[32] Mao X G, Zhang H Y, Qian X Y, Li A, Zhao G Y, Jing R L. TaNAC2, a NAC-type wheat transcription factor conferring enhanced multiple abiotic stress tolerances in., 2012, 63: 2933–2946.

[33] Mao X G, Chen S S, Li A, Zhai C C, Jing R L. Novel NAC transcription factor TaNAC67 confers enhanced multi-abiotic stress tolerances in., 2014, 9: e84359.

[34] 金善寶. 中國小麥學. 北京: 中國農業出版社, 1996. pp 95–124. Jin S B. Chinese Wheat. Beijing: China Agriculture Press, 1996. pp 95–124 (in Chinese).

[35] Shiriga K, Sharma R, Kumar K, Yadav S K, Hossain F, Thirunavukkarasu N. Genome-wide identification and expression pattern of drought-responsive members of the NAC family in maize., 2014, 2: 407–417.

[36] Singh A K, Sharma V, Pal A K, Acharya V, Ahuja P S. Genome-wide organization and expression profiling of the NAC transcription factor family in potato (L.)., 2013, 20: 403–423.

[37] Borrill P, Harrington S A, Uauy C. Genome-wide sequence and expression analysis of the NAC transcription factor family in polyploid wheat.:, 2017, 7: 3019–3029.

[38] Huysmans M, Buono R A, Skorzinski N, Radio M C, De Winter F, Parizot B, Mertens J, Karimi M, Fendrych M, Nowack M K. NAC transcription factors ANAC087 and ANAC046 control distinct aspects of programmed cell death in the Arabidopsis columella and lateral root cap., 2018, 30: 2197–2213.

[39] Guo S, Dai S, Singh P K, Wang H, Wang Y, Tan J L H, Wee W, Ito T. A membrane-bound NAC-like transcription factor OsNTL5 represses the flowering in., 2018, 9: 555.

Transcription factor geneinvolved in regulation spike length and spikelet number per spike in common wheat

ZHANG Hong-Juan1,2, LI Yu-Ying2,3, MIAO Li-Li2, WANG Jing-Yi2, LI Chao-Nan2, YANG De-Long1,*, MAO Xin-Guo1,2,*, and JING Rui-Lian2

1College of Life Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu, China;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Key Laboratory of Crop Germplasm and Utilization, Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China;3College of Agriculture, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China

NAC transcription factor is a plant specific superfamily and plays an essential role in regulating plant growth and development and stress response. Our previous research indicated thatinvolved in the response to various environmental stimuli and its overexpression resulted in enhanced tolerance to multiple abiotic stresses. To probe its roles in plant growth and development, a panel consisted of 36 wheat accessions with high diversity we need for polymorphism assays. The genomic sequences, covering the promoter region and gene coding region, were obtained by Sanger sequencing, and named as-,-, and-according to their genomic origins. For-,a SNP (A/G) at –1516 nt and a 126 bp InDel between –873 and –748 nt were identified in the promoter region, and one CAPS and one allele specific marker were developed, respectively. For, two SNPs, at –2014 and –1916 nt were detected, and two dCAPS markers were developed accordingly. For-, two SNPs, one at –1795 nt in the promoter region, and the other at 357 nt in the gene coding region were identified, and one CAPS and one dCAPS marker were designed, respectively. To probe the relationship of molecular markers and potential agronomic traits, we introduced a population (PA) with 282 common wheat accessions to perform association assay. No association was identified between markers from-andand agronomic traits. However, strong associations were identified between SNP-D-1and spike length (SL), and between SNP-D-2 and the total number of spikelet per spike (TNSS). Haplotype assays showed there were three major haplotypes in PA, i.e.-6D-1, -2, -3. Furthermore, the SL of accessions with-6D-3 was significant longer than that with the other two haplotypes under all 30 environments, and the TNSS was significant larger under 22 environments, thus-6D-3 is an elite haplotype for both SL and TNSS, which was selected positively in the process of wheat breeding in China. Further transgenic experiments revealed that-rice lines had lager panicles and more seeds relative to wild type, which is consistent with the association assay results. Therefore,is a potential candidate gene in spike traits improvement, and-might be used in marker assistant molecular breeding in wheat.

wheat;transcription factor; single nucleotide polymorphism; functional marker; haplotype; association assay

本研究由國家重點研發計劃項目(2017YFD0300202)和甘肅省現代農業產業技術體系項目(GARS-01-04)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Plan (2017YFD0300202) and Gansu Agriculture Research System (GARS-01-04).

楊德龍, E-mail: yangdl@gsau.edu.cn, Tel: 0931-7631742; 毛新國, E-mail: maoxinguo@caas.cn, Tel: 010-82105829

E-mail: 1412360690@qq.com

2019-01-23;

2019-05-12;

2019-05-22.

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190521.1451.006.html

10.3724/SP.J.1006.2019.91009