甘草內生真菌GRE9揮發性成分分析

許哲祥　姜碩　王宇晴　鄭春英

摘要 [目的]比較甘草內生真菌GRE9與宿主植物甘草揮發性成分的相關性。[方法]利用氣相-質譜法分析甘草內生真菌GRE9發酵液和菌絲體揮發性物質。[結果]內生真菌GRE9發酵液及菌絲體既含有與宿主植物相同的揮發性成分，也含有特異性揮發性物質。[結論]甘草內生真菌GRE9是具有應用前景的內生菌。

關鍵詞 內生真菌;揮發性成分;GC-MS

中圖分類號 R284文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）17-0198-03

Abstract [Objective]The research aimed to compare the correlation between the endophytic fungi GRE9 and? the volatile components of the host plant Glycyrrhiza uralensis.[Method]The volatile compounds of GRE9 strains fermented broth and its mycelium were analyzed by GCMS.[Result]The volatile components in the GRE9 fermented broth and its mycelium not only contained the same volatile components with the host crude drugs，but also contained the specific volatile substances. [Conclusion] GRE9 strain is a Glycyrrhiza uralensis endophytic fungus which has wild application prospect in future.

Key words Endophytic fungus;Volatile compounds;GCMS

研究表明，微生物在生長發育過程中能產生多種揮發性物質[1]，這些揮發性物質能夠刺激周圍植物的生長、促進其次生代謝產物的積累[2]，誘導植物產生抗病能力，同時也在生物防治、物種通訊中起著重要的作用[3]。研究植物內生菌所產生的揮發性成分對于研究宿主植物與內生菌之間的關系及內生菌次生代謝物的動態積累具有重要的意義。

烏拉爾甘草（Glycrrhiza uralensis Fisch）為北方瀕危藥用植物[4]，具有抗病毒[5]、抗炎[6]、抗腫瘤[7]等多種活性作用，是臨床常用大宗中草藥之一。栽培種植雖然是解決甘草緊缺的替代方法[8]，但其采收期為2～3年，種植企業及農戶資金回籠較慢。內生菌由于參與宿主植物體內成分的生物轉化、誘導藥用植物次生代謝產物的產生[9]，因此作為研究目標，利用微生物發酵法生產瀕危藥用植物的活性成分，減少藥用植物資源的使用。筆者以甘草內生真菌GRE9為研究對象，對其揮發性成分進行分析檢測，考察甘草內生真菌揮發性成分與甘草揮發性成分的相關性，為深入研究甘草內生真菌揮發性成分奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養

供試菌：內生真菌GRE9，黑龍江大學生物制藥專業實驗分離得到。PDB培養基：同參考文獻[10]。

1.2 儀器與試劑

GC-MS聯用儀（7890AGC-240MS，美國安捷倫公司）。試劑均為分析純。

1.3 供試品溶液的制備

將GRE9活化，活化后接種于60 mL PDB培養基中（搖床培養條件：28 ℃，140 r/min，3 d），制成1×10 7CFU/mL種子培養液。以5%（V/V）種子液轉接至300 mL PDB中按上述搖床培養條件培養14 d，抽濾，分別得到GRE9的發酵液及菌絲體。

1.3.1 內生真菌GRE9發酵液供試品的制備。

取“1.3”項下的發酵液，以乙酸乙酯萃取3次（3×100 mL），合并萃取液，50 ℃低溫濃縮至干，以10 mL乙酸乙酯溶解，制得發酵液供試品，備用。

1.3.2 內生真菌GRE9菌絲體供試品的制備。

取“1.3”項下的菌絲體20 g，超聲破碎后，以乙酸乙酯萃取3次（3×100 mL），隨后同“1.3.1”，制得菌絲體供試品，備用。

1.3.3 對照藥材供試品溶液的制備。

稱取甘草生藥粉末10 g，加入乙酸乙酯100 mL，超聲提取1 h，過濾，取濾液，將濾液于50 ℃條件下減壓濃縮至10 mL，得對照藥材供試品溶液，冷藏備用。

1.3.4 空白對照品的制備。

取滅菌后的PDB培養基600 mL，抽濾，50 ℃低溫濃縮至100 mL，乙酸乙酯萃取3次（3×100 mL），隨后同“1.3.1”，制得培養基空白對照品，冷藏備用。

1.4 GC-MS分析條件

1.4.1 GC條件。Rtx-5ms毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;升溫程序：在60 ℃條件下保持6 min，隨后，以10 ℃/min 的速率升高至160 ℃，此溫度條件下保持5 min，再以20 ℃/min的速率升高至240 ℃，此溫度條件下保持10 min;進樣溫度為250 ℃;載氣（He）流速為1 mL/min;壓力設置為57.4 kPa;分流比（30∶1）;進樣量精確至1 μL。

1.4.2 MS條件。電子轟擊（EI）離子源;該條件下設置離子源溫度230 ℃;接口溫度250 ℃;溶劑延遲2.5 min;數據采集方式Scan;質量掃描范圍m/z 40～450;檢測器增益電壓1.18 kV。

1.5 試驗方法

采用GC-MS對GRE9菌株揮發性成分進行研究，通過質譜數據庫（NIST Chemical Structures庫）檢索確定各樣品中的化學成分，并采用面積歸一化法確定各種化學成分的相對含量。

2 結果與分析

2.1 內生真菌GRE9發酵液揮發性成分分析

通過GC-MS分析，GRE9菌株發酵液中揮發性成分有13個峰，結果如圖1所示。GRE9發酵液揮發性成分通過質譜數據庫檢索，確定了13個峰，結果見表1。

2.2 內生真菌GRE9菌絲體揮發性成分分析

采用GC-MS分析，在GRE9菌株菌絲體的揮發性成分中發現并確定了7個峰，其結果如圖2，且這7個峰通過質譜數據庫檢索，分別得到了確認，其具體物質名稱及相對含量見表2。

2.3 對照品藥材揮發性成分分析

通過GC-MS分析甘草生藥供試品的揮發性成分，發現并確定了12個峰，其結果如圖3，甘草生藥樣品揮發性成分通過質譜數據庫檢索，分別確認了12個峰的具體物質名稱及其相對含量，結果如表3所示。

2.4 空白對照品中揮發性成分分析 通過GC-MS分析空白PDB培養基樣品的揮發性成分，發現并確定了3個峰，其結果如圖4所示，這3個峰通過質譜數據庫檢索，分別確認其具體物質名稱及其相對含量，結果見表4。

對比圖1～4，分析表1～4，發現有2種化合物（鄰苯二甲酸異丁酯和鄰苯二甲酸二丙戊酯）為4種供試品所共有，甘草內生真菌GRE9發酵液中有8種特有成分;菌絲體中含有5種特有成分;甘草生藥含有8種特有成分。對比甘草內生真菌GRE9發酵液與甘草生藥供試品檢測結果發現，二者相同的成分為十六烷酸和十八烷酸，而其余成分均具有差異性。

3 結論

甘草內生菌GRE9發酵液中存在與宿主植物甘草相同的揮發性成分，表明甘草內生菌GRE9與甘草可能具有相同的代謝機制;同時，甘草內生真菌GRE9所含有的特異性揮發性成分，說明內生真菌GRE9雖然分離自甘草莖部，但具有菌株生長特異性，更證實該菌具有一定的研究價值，為進一步研究和綜合利用GRE9菌株奠定基礎。

參考文獻

[1] ROJASSOLS D，ZETTERSALMN E，CONTRERASPREZ M，et al.Pseudomonas stutzeri E25 and Stenotrophomonas maltophilia CR71 endophytes produce antifungal volatile organic compounds and exhibit additive plant growthpromoting effects[J].Biocatalysis and agricultural biotechnology，2018，13：46-52.

[2] ZHOU J Y，LI X，ZHENG J Y，et al.Volatiles released by endophytic Pseudomonas fluorescens promoting the growth and volatile oil accumulation in Atractylodes lancea[J].Plant physiology and biochemistry，2016，101：132-140.

[3] JALALI F，ZAFARI D，SALARI H.Volatile organic compounds of some Trichoderma spp.increase growth and induce salt tolerance in Arabidopsis thaliana[J].Fungal ecology，2017，29：67-75.

[4] WANG D，PANG Y X，WANG W Q，et al.Effect of molybdenum on secondary metabolic process of glycyrrhizic acid in Glycyrrhiza uralensis Fisch.[J].Biochemical systematics and ecology，2013，50：93-100.

[5] HE S H，LIU H G，ZHOU Y F，et al.Liquiritin （LT） exhibits suppressive effects against the growth of human cervical cancer cells through activating Caspase3 in vitro and xenograft mice in vivo[J].Biomedicine & pharmacotherapy，2017，92：215-228.

[6] TAO W W，DUAN J A，ZHAO R H，et al.Comparison of three officinal Chinese pharmacopoeia species of Glycyrrhiza based on separation and quantification of triterpene saponins and chemometrics analysis[J].Food chemistry， 2013，141（3）：1681-1689.

[7] 吳桐，白長勝，譚佳音，等.烏拉爾甘草內生真菌的分離及其抑菌活性研究[J].中國食品學報，2014，14（2）：154-160.

[8] WANG D，WAN C Y，WANG W Q，et al.Effects of manganese deficiency on growth and contents of active constituents of Glycyrrhiza uralensis Fisch.[J].Commun Soil Sci Plant Anal，2012，43（17）：2218-2227.

[9] BASTOS D Z L，PIMENTEL I C，DE JESUS D A，et al.Biotransformation of betulinic and betulonic acids by fungi [J].Phytochemistry，2007，68：834-839.

[10] 徐慧超，孫婷媛，翟李欣，等.產甘草次酸內生真菌RE7的鑒定及抑菌活性研究[J].中國新藥雜志，2016，25（1）：102-105.