基于離子液體雙水相萃取番茄中抗氧化酶研究

李夢瑤　王書雅　謝云峰　黃蔚霞　翟晨　劉云國

摘要 基于 [C4mim] Cl/K2HPO4雙水相體系，建立了萃取分離番茄中5種抗氧化酶（CAT、POD、SOD、AAO、PPO）的新方法。以番茄中抗氧化酶的活性為指標，研究了不同種類的離子液體和用量、K2HPO4的用量、體系pH及萃取時間等參數對番茄中抗氧化酶活性的影響，并與傳統的緩沖溶液法提取效果進行比較。結果表明：當K2HPO4濃度為0.16 g/mL，[C4mim] Cl濃度為0.40 g/mL，pH為7.5，30 ℃ 200 r/min提取20 min時，提取的5種抗氧化酶活性比緩沖溶液法提取的酶活性高、穩定性好且萃取時間縮短了10 min。該提取方法操作簡單，且實現多種酶的同時、快速、高活性提取，為植物性農產品的多酶快速提取提供了一種新的思路。

關鍵詞 離子液體;雙水相;抗氧化酶;萃取;酶活性

中圖分類號 TS201.2文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）17-0179-03

Abstract Based on the aqueous twophase system formed by ionic liquid chloro1butyl3methylimidazolium [C4mim]Cl and K2HPO4， a new method for extraction of five antioxidant enzymes（CAT， POD， SOD， AAO， PPO） from tomato was established. Taking the activity of antioxidant enzymes in tomato as the index， the effects of different kinds of ionic liquids， the amount of K2HPO4， the pH and the extraction time on the activities of antioxidant enzymes in tomato were studied. The results showed that the optimal condition was： K2HPO4 concentration was 0.16 g/mL， [C4mim] Cl concentration was 0.40 g/mL， pH 7.5， 30 ℃ 200 r/min for 20 min， time reduced by 10 min. The extraction method was simple in operation， and realized simultaneous， rapid and highactivity extraction of various enzymes， which provided a new idea for rapid extraction of multienzymes in plant agricultural products.

Key words Ionic liquid;Aqueous twophase;Antioxidant enzyme;Extraction;Enzyme activity

番茄（Lycopersicon esculentum）屬茄科茄屬，為草本植物，其含有豐富的營養物質，用途廣泛（生食、菜用及各種加工制品），是我國的主栽蔬菜[1]。番茄等果蔬采摘后，在后熟到衰老的過程中，其機體內的活性氧和酶保護系統隨著果蔬的代謝活動而發生變化[2-4]。其在貯藏運輸的過程中，由于呼吸代謝作用導致氧自由基含量、丙二醛（MDA）含量增加，激發抗氧化酶（過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、抗壞血酸氧化酶（AAO））等保護系統消除活性氧自由基等有害物質，從而可以避免造成組織損傷、細胞衰老或死亡，同時延長果蔬的貯藏期[4]。果蔬體內抗氧化酶活性高低可以作為判定果實品質劣變程度、貯藏貨架期以及成熟衰老的標志[4-6]。目前，提取植物性農產品抗氧化酶更多依賴于傳統的緩沖溶液法，該方法耗時長、提取酶活性低、穩定性較差。

離子液體（ionic liquid，ILs），作為一種新型的綠色溶劑，因具有不揮發、溶解性強等多種獨特的性質，目前在分離萃取等領域表現出良好的應用前景[7]。離子液體雙水相體系是由親水性離子液體和無機鹽組成的兩相[8]。離子液體雙水相蒸氣壓極低，與有機溶劑萃取法相比不會因揮發而引發環境污染和威脅操作者健康等問題，體系的萃取分離條件溫和，能使絕大部分生物分子保持活性同時具備分相快、不易乳化、離子液體可循環使用等特性，是近年來出現的一種極有前途的新型分離技術[9-10]。目前，離子液體及離子液體雙水相體系被廣泛應用于萃取分離重金屬離子[11-12]、生物活性物質[13-15]、蛋白質[16-18]、酶[19-21]等。基于離子液體雙水相體系，陳靜等[20]成功地萃取了胰蛋白酶，并對其萃取機理進行研究;曾穎等[21]萃取木瓜蛋白酶，并證明能保持較高的酶活力。目前，采用離子液體雙水相提取法對植物源農產品中多種酶的同時、快速、高活性提取的研究較少。

筆者以親水性離子液體氯代1-丁基-3-甲基咪唑[C4mim] Cl和K2HPO4形成的雙水相體系對番茄中的抗氧化酶進行萃取研究，以抗氧化酶的活性為指標，考察了離子液體種類及濃度、萃取時間、無機鹽用量、體系pH、靜置時間對番茄中抗氧化酶活性的影響，并與傳統提取法相比較，提出了一種基于離子液體雙水相體系，實現多種抗氧化酶同時、快速、高效、高活性的萃取分離方法。

1 材料與方法

1.1 材料

過氧化氫酶（2 000 U/mg）購自上海士鋒生物科技有限公司;磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、30%過氧化氫H2O2、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）均為分析純，購自北京化工廠;氯代1-丁基-3-甲基咪唑（[C4mim]Cl），氯代1-乙基-3-甲基咪唑（[C2mim]Cl），四氟硼酸1-丁基-3-甲基咪唑（ [C4mim]PF4）均為分析純，購自上海愛純生物有限公司。

1.2 儀器

Milli-Q 超純水系統（美國Millipore公司）;渦旋混勻器（德國IKA公司）;紫外可見分光光度計（日本Hitachi公司）;恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）;PB-10型pH計（德國Sartorius公司）;離心機（德國Eppendorf公司）;Synergy Mx酶標儀（美國 Bio-Tek公司）。

1.3 方法

1.3.1 離子液體雙水相萃取抗氧化酶。

準確稱取一定量的離子液體和K2HPO4，加入到10 mL刻度比色管中，加水溶解，溶解完全觀察到體系分為上下兩相（圖1），上相富集離子液體，下相富集K2HPO4。用不同pH的緩沖溶液調節體系的酸堿度[22]，加入0.5 g研磨成漿的番茄泥，番茄位于兩相中間（圖2），于30 ℃、200 r/min恒溫培養箱中振蕩一定時間后靜置，取上清液進行酶活性測定。

1.3.2 緩沖液法萃取分離抗氧化酶。

參考文獻[23]，基于緩沖溶液法對5種抗氧化酶進行提取：取新鮮的番茄，洗凈晾干，于攪拌機中打碎10 min，再冰浴狀態下用研缽研磨至泥狀。分別配制pH 7.8的50 mmol/L PBS，緩沖溶液提取CAT、SOD、POD三種抗氧化酶和pH 6.0的50 mmol/L PBS緩沖液提取AAO、PPO兩種抗氧化酶，取4.5 mL酶提取液加入0.5 g研磨成漿的番茄泥，在4 ℃高速離心機中以 5 000 r/min的轉速離心30 min，取上清液放入4 ℃環境中待用。

1.3.3 抗氧化酶活性測定。

過氧化氫酶（CAT）活性測定：通過測定1 min內H2O2在240 nm波長下消耗量，可計算得CAT活性[24];抗壞血酸氧化酶（AAO）活性測定：通過測定AsA的氧化量，可計算得AAO活性;多酚氧化酶（PPO）活性測定：PPO 能夠催化鄰苯二酚產生醌，后者在 410 nm 有特征光吸收[23];過氧化物酶（POD）活性測定：采用愈創木酚法測定[25];超氧化物歧化酶（SOD）活性測定：采用核黃素（NBT）法測定[26]。

2 結果與分析

2.1 萃取參數優化

2.1.1 離子液體種類和用量的選擇。

研究以CAT活性為考察指標，對提取條件進行優化。將[C4mim]Cl、[C2mim]Cl及[C4mim]PF4與K2HPO4制備成相同濃度的雙水相體系，分別加入相同濃度的酶溶液進行提取，通過檢測酶活性考察不同離子液體的提取效果。由圖3可知，[C4mim]Cl雙水相提取的酶活性最高，其次為[C2mim]Cl，[C4mim]PF4提取效果最差，因此選擇[C4mim]Cl作為雙水相體系中的離子液體。

制備濃度為0.26～0.47 g/mL的[C4mim]Cl離子液體雙水相體系，固定體系pH、提取時間以及K2HPO4的加入量，對離子液體的用量進行考察。由圖4可知，在較低濃度時，酶的提取效果較差，隨離子液體濃度的提高，酶活性逐漸升高，當濃度達0.40 g/mL時，提取效果最好，之后隨著離子液體濃度升高，酶活性逐漸降低，因此離子液體濃度應控制在0.40 g/mL。

2.1.2 K2HPO4加入量的選擇。

隨著鹽量的增加，上下相體積比逐漸減小，鹽濃度過高或者過低，均不能形成雙水相。由此可知，無機鹽是雙水相體系成相的主要原因之一，控制鹽濃度為0.10～0.24 g/mL，保持pH不變，對CAT活性進行測試。由圖5可知，隨著鹽濃度的增大，提取效果逐漸提高，在0.16 g/mL時達到最大。隨著無機鹽濃度增大，鹽析作用加強，酶更趨向于分配上相，但過多的鹽導致酶的活性下降，因此，鹽濃度最優值為0.16 g/mL。

2.1.3 雙水相體系pH的確定。

配制pH為6.5～9.5的離子液體雙水相體系，考察體系中不同pH條件對酶活性的影響。由圖6可知，在離子液體溶液雙水相體系中，當pH<7.5和pH>7.5 時，酶活性均較低，在酸性或堿性條件下接近酶的等電點導致溶解性變差，部分析出致使酶活性下降。故試驗中為保持酶的活性，雙水相體系的pH應保持在7.5左右。

2.1.4 萃取和靜置時間的確定。

準確稱取0.5 g番茄泥于制備好的離子液體雙水相體系中，充分混合均勻后，置于30 ℃、200 r/min的恒溫培養箱中提取CAT，通過考察不同萃取時間和靜置時間對提取的酶活性差異，確定最佳的萃取時間和靜置時間。由圖7可知，隨萃取時間增加，酶活性逐漸增加，當萃取時間達20 min后，酶活性逐漸穩定，因此萃取時間選擇為20 min。

在確定萃取時間的條件下，考察不同靜置時間下提取的CAT活性的差異。由圖7可知，酶活性隨著靜置時間的增加而升高，并在15 min時達到最高，之后由于放置時間的延長部分酶失活，導致酶活性有所下降，故選取的靜置時間為15 min。

2.2 離子液體雙水相法與緩沖溶液提取法的對比

對傳統的緩沖溶液提取法與離子液體雙水相法進行對比。由表1可知，離子液體雙水相萃取得到的CAT、SOD、AAO、PPO這4種抗氧化酶活性高于傳統的緩沖溶液提取法。由于該研究以[C4mim] Cl/K2HPO4形成上相富集離子液體和下相富集無機鹽的雙水相體系，基于鹽析作用蛋白質水溶液在高濃度的中性鹽中會析出產生沉淀，得到的蛋白質一般不失活，一定條件下又可重新溶解，基于配位作用蛋白質上的氨基酸會和離子液體發生配位反應，從而大大增強了蛋白質在離子液體中的溶解度，使蛋白質富集在上相的離子液體中[9]。然而，離子液體雙水相法提取的POD活性低于緩沖溶液提取方法，可能是由于離子液體雙水相體系pH較高，導致了部分酶活性喪失，后期將繼續對POD酶提取條件進行優化，但離子液體雙水相法提取的POD其標準差小于傳統方法得到的酶活性的標準差。總體來說，離子液體雙水相萃取法優于傳統的緩沖溶液提取方法，且得到的酶活性更加穩定，該方法受到的外界干擾更小。

3 結論

該研究基于[C4mim]Cl/K2HPO4雙水相體系，建立了萃取分離番茄中5種抗氧化酶（CAT、POD、SOD、AAO、PPO）的新方法。以抗氧化酶活性為指標，對離子液體的種類及濃度、提取時間、無機鹽的用量、體系pH、萃取時間等條件進行了優化，并與傳統的緩沖溶液提取法相比較。結果表明提取番茄中抗氧化酶的最佳條件是采用濃度為0.40 g/mL[C4mim]Cl離子液體，K2HPO4濃度為0.16 g/mL，pH為7.5，萃取時間為20 min，靜置時間為15 min。該研究建立的離子液體雙水相提取方法成功提取了番茄中5種抗氧化酶，酶活性比傳統提取方法高（除POD外），且穩定性較好，萃取時間縮短了10 min。該研究提出了一種基于離子液體雙水相體系的快速、高效、高活性的抗氧化酶分離方法。

參考文獻

[1] 羅丹.不同處理對番茄果實采后品質變化的影響[D].青島：青島農業大學，2017.

[2] 齊景凱，曹霞，張曉雷.粉果番茄貯藏期間主要性狀變化規律研究[J].北方園藝，2016（1）：117-120.

[3] 尚春明，高振江，胡雪，等.不同貯藏方式對番茄授粉效果的影響[J].北方農業學報，2018，46（5）：113-116.

[4] 魏云瀟，葉興乾.果蔬采后成熟衰老酶與保護酶類系統的研究進展[J].食品工業科技，2009，30（12）：427-431.

[5] 張彪，張文濤，李喜宏，等.氣體二氧化氯對櫻桃番茄貯藏品質的影響[J].食品研究與開發，2017，38（8）：173-176.

[6] 鄧紅軍，茅林春.采后果蔬機械損傷愈合研究進展[J].食品安全質量檢測學報，2018，9（11）：2744-2748.

[7] 閆華，張紅梅，張麗靜，等.離子液體研究進展[J].山東化工，2016，45（23）：55-57.

[8] 陳旭偉，毛全興，王建華.離子液體在蛋白質萃取分離中的應用[J].化學進展，2013，25（5）：661-668.

[9] 劉曉庚，高梅，陳梅梅.離子液體雙水相體系及其在蛋白分離中的應用[J].中國糧油學報，2013，28（4）：118-123.

[10] TANG J，SONG H，FENG X T，et al.Ionic liquidlike pharmaceutical ingredients and applications of ionic liquids in medicinal chemistry：Development，status and prospects [J/OL].Current medicinal chemistry，2019[2019-04-05].http：//www.eurekaselect.com/162824/article.DOI：10.2174/0929867325666180605123436.

[11] 宋飛躍，薛永波，高欣，等.不同離子液體雙水相萃取鈀[J].應用化學，2019，36（3）：335-340.

[12] ATANASSOVA M，KURTEVA V.Synergism in the solvent extraction of europium（III）with thenoyltrifluoroacetone and CMPO in methylimidazolium ionic liquids[J].Journal of solution chemistry，2019，48（1）：15-30.

[13] LIANG Q，ZHANG J S，SU X G，et al.Extraction and separation of eight ginsenosides from flower buds of Panax ginseng using aqueous ionic liquidbased ultrasonicassisted extraction coupled with an aqueous biphasic system [J].Molecules，2019，24（4）：1-12.

[14] NIE L R，SONG H，YOHANNES A，et al.Extraction in choliniumbased magnetic ionic liquid aqueous twophase system for the determination of berberine hydrochloride in Rhizoma coptidis[J].RSC Advances，2018，8（44）：25201-25209.

[15] 宋力飛，劉常青，李曼莎，等.星點設計-響應面法優化黃芪雙水相萃取工藝[J].中成藥，2017，39（1）：70-75.

[16] 田盼盼，程超，汪興平.逐級鹽析法結合雙水相萃取純化葛仙米藻藍蛋白[J].食品科學，2015，36（24）：16-22.

[17]? 曾群.新型綠色溶劑的合成及其雙水相體系在蛋白質綠色分離中的應用研究[D].長沙：湖南大學，2014.

[18] 趙金花，王宇松，鐘麗聰，等.N-甲基-N-乙基嗎啉四氟硼酸鹽離子液體的合成及其雙水相萃取牛血清蛋白的研究[J].生命科學儀器，2013，11（Z1）：58-62.

[19] YANG H P，CHEN L，ZHOU C S.Improving the extraction of lphenylalanine by the use of ionic liquids as adjuvants in aqueous biphasic systems[J].Food chemistry，2018，245：346-352.

[20] 陳靜，王玉枝，黃松云.季銨鹽類環氧官能團離子液體-雙水相萃取法萃取分離萃取胰蛋白酶[J].當代化工研究，2016（5）：110-111.

[21] 曾穎，余壘，朱新儒，等.鹽析法聯合離子液體雙水相純化木瓜蛋白酶[J].食品科學，2018，39（24）：261-267.

[22] 鄧凡政，郭東方.離子液體雙水相體系萃取分離牛血清白蛋白[J].分析化學，2006，34（10）：1451-1453.

[23] 劉祖祺，張石城.植物抗性生理學[M].北京：中國農業出版社，1994：370-372.

[24] 中國國家標準化管理委員會.蜂花粉中過氧化氫酶的測定方法紫外分光光度法：GB/T 23195—2008[S].北京：中國標準出版社，2008.

[25] MATUSCHEK E，SVANBERG U.The effect of fruit extracts with polyphenol oxidase（PPO）activity on the in vitro accessibility of iron in hightannin sorghum[J].Food chemistry，2005，90（4）：765-771.

[26] DHINDSA R S，DHINDSA P P，THROPE T A.Leaf senescence：Conrrelated with increased levels of membrane and lipid peroxidation，and decreased levels of superoxide dismutase and catalase[J].J Exp Bot，1981，32（3）：93-101.