十字花科植物DFR蛋白的生物信息學分析

胡燕 尹明智 匡光煉 黃杰 嚴秋香

摘要 采用生物信息學的方法分析已經在GenBank上注冊十字花科植物的DFR基因序列及相應氨基酸序列，并對其理化性質、結構特征、系統進化關系等進行預測。結果表明，十字花科植物的DFR蛋白大部分都有6個外顯子，分子質量36 481.89～43 129.21 Da，大多數蛋白亞細胞定位于葉綠體中;除了BnaDFRA402，其他的DFR蛋白均具有酶活性部位、NADP結合位點和底物特異結合位點，這些保守區域形成了5個motifs;每個DFR蛋白均有多個磷酸化位點，以Ser為主，以Thr和Tyr磷酸化為輔;二級結構均由α-螺旋、β-轉角、延伸鏈和無規則卷曲組成，其中α-螺旋為主要結構元件。

關鍵詞 十字花科;花青素;DFR蛋白;生物信息學

中圖分類號 S188文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）17-0103-05

Abstract The DFR gene sequences and corresponding amino acid sequences registered on GenBank in Cruciferae plants were analyzed by means of bioinformatics， their physical and chemical properties，structural characteristics and phylogenetic relationships were predicted. The results showed that most of DFR proteins in Cruciferae plants had six exons with molecular weight ranging from 36 481.89 Da to 43 129.21 Da.Most of the protein subcells were located in chloroplasts. Except BnaDFRA402， other DFR proteins had enzymatic activity sites， NADP binding sites and substrate specific binding sites， which formed five motifs. Each DFR protein had multiple phosphorylation sites，in which Ser was the dominant and Thr and Tyr were the minor. The secondary structures were composed of alpha helix， beta turn， extended strand and random coil， and alpha helix was the main structural element.

Key words Cruciferae;Anthocyanin;DFR protein;Bioinformatics

植物花色主要是由類黃酮、類胡蘿卜素和甜菜色素三大色素決定的。花青素是一類十分重要的類黃酮化合物，廣泛分布于各種植物中，其賦予了植物花、葉和果實各種顏色[1]，它主要調控花、葉和果實生成紅色、紫色和藍色。花色苷合成過程中，二氫黃酮醇轉變成花色苷的反應非常復雜，二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）是這一轉變中起作用的第一個酶，失去DFR活性的突變體產生象牙色或者白色[2]。DFR是花青素生物合成途徑中的關鍵酶，是一個重要的調控點。它以二氫堪非醇（dihydrokaempferol，DHK）、二氫櫟皮黃酮（dihydroquercetin，DHQ）和二氫楊梅黃酮（dihydromyricetin，DHM）為底物，在輔因子NADPH的作用下將4位的羰基還原為羥基，產生相應的不穩定無色花青苷元，然后這些無色花青苷元在花色素合酶（anthocyanidin synthase，ANS）和類黃酮3-O-糖基轉移酶（flavonoid 3-O-glucosyltransferase，3GT）的催化下分別形成矢車菊素、天竺葵素和翠雀素[3-5]。DFR基因調控機制的研究對于了解花色素苷生化合成途徑和花朵顯色的分子機制有重要的意義[6]。

目前，DFR基因在很多植物中均已被克隆，由于DFR基因具有底物特異性，利用該特點可以定向改良花的顏色[7]。自1987年Meyer等[8]將玉米DFR基因導入矮牽牛RC01突變體使花色由白色變為淡磚紅色以來，其在改造花色方面的應用取得了很多進展[9-12]。該研究采用生物信息學的方法，對十字花科植物DFR氨基酸序列的組成成分、理化特性、亞細胞定位、功能結構域等進行預測和推斷，以期為進一步研究十字花科花色素苷生物合成的分子機制以及選育不同花色的植物資源提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 數據獲取

以dihydroflavonol 4reductase為信息探針搜索NCBI Gene數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/），獲得十字花科植物的基因序列及編碼的相應蛋白質序列。

1.2 DFR蛋白質序列分析及亞細胞定位

利用ProtParm 在線分析軟件（http：//web.expasy.org/protparam）預測各蛋白質的相對分子質量及等電點信息[13]。使用WoLF PSORT在線分析軟件進行蛋白質的亞細胞定位（http：//www.genscript.com-/wolf-psort.html）。

技術的發展，公共數據量日益增加促使生物信息學成為后基因組時代用于預測和研究基因功能的重要方法。該研究應用生物信息學的方法對擬南芥、甘藍型油菜、甘藍、蘿卜等十字花科植物的24個DFR蛋白序列的理化性質、結構特征和系統進化關系等進行預測和分析，結果表明十字花科的DFR蛋白均具有NAD（P）結合位點和底物特異結合位點，且序列較為保守，亞細胞定位主要在葉綠體，磷酸化以Ser為主，以Thr和Tyr磷酸化為輔，但不同種屬的DFR蛋白序列具有一定差異，同一種屬的DFR蛋白并不聚在一起，表明這些DFR在功能上也是有差異的，這些分析為該類基因表達和功能研究提供了參考，也為將來研究油菜花色形成分子機制及利用基因工程技術創新彩色油菜種質資源提供了基礎資料。

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