豬流行性腹瀉病毒安徽分離株N基因的克隆與表達

潘孝成　沈學懷　趙瑞宏　戴銀　胡曉苗　侯宏艷　周學利　張丹俊

摘要 [目的]克隆和表達豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的N基因。[方法]采用RT-PCR方法對PEDV FD株的N基因進行擴增，將擴增產物連接pET-28B載體，陽性質粒轉入大腸桿菌BL21感受態細胞，誘導表達目的蛋白。[結果]PEDV FD株N基因序列全長為1 326個核苷酸，編碼441個氨基酸;重組N蛋白為可溶性表達，大小約58 ku;Western blot檢測結果表明，重組N蛋白與PEDV抗體陽性血清發生特異性反應。[結論]該試驗制備的PEDV重組N蛋白具有較好的免疫原性，可用于PEDV診斷方法的開發及相關研究。

關鍵詞 豬流行性腹瀉病毒;N蛋白;原核表達

中圖分類號 S852.65 +7文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）17-0091-03

Abstract [Objective] To clone and express the N gene of porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）. [Method] N gene of PEDV FD strain was amplified by RTPCR and clone into pET28B vector， the positive plasmid was transformed into BL21 competent cell of Escherichia coli to? express N protein under IPTG induction. [Result]? N gene of PEDV FD strain contained 1 326 nucleotides in whole length， encoding 441 amino acids. The expressed recombinant N protein was soluble and it was about 58 ku. Westernblot detection results showed that the N protein and PEDV positive sera reacted specifically. [Conclusion] The recombinant N protein of PEDV had a good immunogenicity，which could be used for the? diagnosis method development and research of PEDV.

Key words Porcine epidemic diarrhea virus;N protein;Prokaryotic expression

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種以腹瀉、脫水和嘔吐為特征的傳染病，尤其以哺乳仔豬受害最嚴重，發病率可達100%，平均病死率為50%，10日齡內哺乳仔豬死亡率可高達90%，成年豬一般無死亡[1]。PEDV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，為有囊膜的、不分節段的、單股正鏈RNA病毒，基因組全長約28 kb，編碼有纖突（spike，S）蛋白、小膜（small envelope，E） 蛋白、膜（membrane，M） 蛋白和核衣殼（nucleocapsid，N） 蛋白4種主要結構蛋白[2]。PEDV 的N蛋白由441個氨基酸組成，主要參與病毒的復制以及誘導特異性免疫反應的產生，而且在PEDV感染早期宿主能夠產生針對N蛋白的高水平抗體，因而利用N蛋白建立PEDV診斷技術具有很好的應用前景[3-6]。筆者對PEDV FD株的N基因進行克隆，原核表達并純化其N蛋白，旨在為進一步建立PEDV的診斷方法提供基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 病毒

PEDV FD株從安徽省肥東縣某發生豬流行性腹瀉病豬場的仔豬小腸黏膜中分離，由安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所獸醫研究室鑒定和保存。

1.2 主要試劑與菌株

RNAiso Plus試劑、反轉錄試劑盒（M-MLV）、限制性內切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、IPTG 和X-gal、pET-28B載體等均購自TaKaRa公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒、E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）、DNA Marker、蛋白Marker等購自生工生物工程（上海）股份有限公司;其他常用試劑均為進口或國產分析純。

1.3 PEDV N基因的擴增

1.3.1 引物合成。

根據GenBank數據庫已發表的PEDV N基因序列，設計了1對引物，P1（NdeI酶切位點）為5′-CTAGCTAGCATGGCTTCTGTCAGCTTTCAGG-3′，P2（XhoI酶切位點）：5′-CCGCTCGAGCCTGTATCGAAGATCTCGTTG-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，擴增1 326 bp基因片段，包含PEDV N基因全長。

1.3.2 RNA提取及cDNA合成。

PEDV FD株細胞培養液200 μL，按TaKaRa公司RNAiso Plus試劑盒說明書提取總RNA，使用TaKaRa公司1st Strand cDNA合成試劑盒進行反轉錄，合成cDNA，-20 ℃下保存備用。

1.3.3 PCR擴增和測序。

以合成的cDNA為模板，利用引物對P1/P2進行PCR擴增，PCR擴增體系如下：cDNA 3 μL、10×PCR buffer 2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL、上下游引物各1 μL（10 pmol/μL）、Ex-Taq酶0.5 μL、ddH2O 15 μL;PCR擴增程序如下：94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min，50 ℃ 50 s，72 ℃ 1.5 min，31個循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃下保存。電泳鑒定為陽性的PCR產物，使用NdeI和XhoI酶切回收PCR產物，將酶切產物連接pET-28B載體，轉入DH5α感受態細胞，挑取單菌落進行培養后提取重組質粒，進行酶切鑒定，將陽性克隆送交生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.4 PEDV N基因的原核表達

1.4.1 重組質粒的誘導表達。

將陽性質粒轉入E.coli BL21（DE3）感受態細胞，涂布于含50 μg/ mL卡那霉素的LB平板上，37 ℃下振蕩培養過夜。挑取單克隆菌落接種到含卡那霉素的LB液體培養基中，37 ℃220 r/min，培養至 OD600為0.4～0.6，加入 IPTG使終濃度為0.5 mmol/L，15 ℃ 160～170 r/min，繼續培養24 h。

收集經IPTG誘導后的菌液和未經IPTG誘導的菌液各1 mL，10 000 r/min 4 ℃高速離心2 min，棄去上清液，加入50 μL PBS后輕輕搖晃離心管，重懸管內沉淀，并加入50 μL 2×蛋白電泳Loading Buffer，在冰浴中用超聲波裂解菌體。將超聲波裂解后的液體加入相同體積的 5×上樣緩沖液，混合均勻后沸水煮浴10 min，經12 000 r/min 4 ℃高速離心2 min，取10 μL樣品進行SDSPAGE電泳分析。

1.4.2 蛋白表達形式分析及純化。

將經IPTG誘導表達后的菌液超聲波裂解，經12 000 r/min 4 ℃高速離心2 min后，分別收集上清和沉淀，并將收集到的上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳。大量誘導菌液500 mL，經超聲波裂解后收集上清，參照蛋白純化說明書操作步驟對收集的上清過鎳柱純化。

1.4.3 重組蛋白的 Western blot檢測分析。

蛋白經SDS-PAGE電泳、轉膜封閉后，用含5%脫脂奶粉的PBST作為轉膜封閉液，4 ℃封閉過夜;將封閉好的NC膜侵泡入200 倍稀釋的PEDV陽性血清，37 ℃孵育1 h;用PBST充分洗滌NC膜，然后浸入用PBST 5 000倍稀釋的羊抗豬IgG-HRP中，37 ℃孵育1 h;PBST充分洗滌后，加入AEC顯色10 min，ddH2O沖洗終止反應。

2 結果與分析

2.1 PEDV N基因的擴增和測序

以提取的RNA為模板，合成cDNA，用合成的cDNA和引物對P1/P2進行PCR擴增。電泳結果顯示，擴增的基因片段大小約1 300 bp（圖1），與預期結果相符。測序結果表明，PEDV FD株N基因序列全長為1 326個核苷酸，編碼441個氨基酸。

2.2 表達產物的SDS-PAGE鑒定

將收集的誘導后菌液和未誘導的菌液處理后進行SDS-PAGE電泳分析，結果如圖2所示，經IPTG誘導后的菌液有一條大約58 ku的蛋白條帶，與目標條帶相符，而未經誘導的重組菌未見相應蛋白條帶。

2.3 重組蛋白的表達分析和純化

將經過IPTG誘導表達后的菌液超聲波裂解，12 000 r/min 4 ℃高速離心2 min后，分別收集上清液和沉淀，并將收集到的上清液和沉淀進行SDS-PAGE電泳，可以看出上清液和沉淀均有一條分子量58 ku左右的條帶，且目的蛋白主要在上清液中，表明重組蛋白為可溶性表達;經鎳柱純化，獲得單一目的條帶，具體見圖3。

2.4 重組蛋白的Western blot檢測結果

將過鎳柱純化后的重組N蛋白經Western blot分析，結果顯示在58 ku處出現清晰的反應條帶，而陰性對照無反應條帶，表明重組N蛋白與PEDV抗體陽性血清發生特異性反應（圖4）。

3 討論

豬流行性腹瀉病于1971年首次發現于英國[7]，我國內地自20世紀80年代初以來陸續有關于PEDV分離和鑒定的報道[8]。從2010年末開始，我國東南沿海地區率先暴發以新生仔豬嚴重腹瀉、高發病率及高死亡率為主要特征的腹瀉疫情，哺乳仔豬的死亡率可達100%，疫情隨后擴散至其他各地，給我國養豬業造成了嚴重的經濟損失[9]。2013年美國也開始暴發仔豬腹瀉疫情，隨后墨西哥、加拿大、韓國以及日本等國家和我國臺灣地區[10]也相繼暴發具有新流行特點的仔豬腹瀉疫情。研究表明，此次全球范圍內PED暴發與PEDV的新變異毒株有關[11-12]。目前，豬流行性腹瀉病的發生在我國呈現常態化[13]，是威脅養豬生產的重要疫病之一，需要給予高度關注。

豬流行性腹瀉病毒的N蛋白由441個氨基酸組成，分子量大小為55～58 ku，在同屬病毒之間的同源性較低，但在同種病毒間具有高度保守性，主要參與病毒的復制以及誘導特異性免疫反應的產生，可作為早期快速檢測PEDV感染的一個重要指標[3]。該研究對PEDV FD株的N基因進行了克隆與原核表達，結果顯示重組N蛋白為可溶性表達;Western blot檢測結果表明，純化重組N蛋白與PEDV抗體陽性血清發生特異性反應，表明PEDV重組N蛋白具有較好的免疫原性。該研究結果為開發PED診斷方法和相關研究奠定了基礎。

參考文獻

[1] 殷震，劉景華.動物病毒學[M].2版.北京：科學出版社，1997：688-689.

[2] LEE C.Porcine epidemic diarrhea virus：An emerging and reemerging epizootic swine virus[J].Virol J，2015，12：1-16.

[3] 吳玉璐，朱建平，楊莘，等.豬流行性腹瀉病毒 N 基因的表達及抗原性分析[J].中國預防獸醫學報，2013，35（4）：299-303.

[4] LEE H K，YEO S G.Cloning and sequence analysis of the nucleocapsid gene of porcine epidemic diarrhea virus Chinju99[J].Virus genes，2003，26（2）：207-212.

[5] COLOGNA R，SPAGNOLO J F，HOGUE B G.Identification of nucleocapsid binding sites within coronavirusdefective genomes[J].Virology，2000，277：235-249.

[6] RODK L，VALCˇEK L，MD B，et al.An ELISA optimized for porcine epidemic diarrhoea virus detection in faeces[J].Vet Microbiol，2005，105（1）：9-17.

[7] PENSAERT M B，DE BOUCK P.A new coronaviruslike particle associated with diarrhea in swine[J].Arch Virol，1978，58（3）：243-247.

[8] 蔡寶祥.介紹幾種新近發現的豬傳染病[J].畜牧與獸醫，1982（5）：218-221.

[9] 劉孝珍，陳建飛，時洪艷，等.2011年豬流行性腹瀉病毒的遺傳變異分析[J].中國預防獸醫學報，2012，34（3）：180-183.

[10] 翁善鋼.2014年國際豬病疫情回顧：豬流行性腹瀉在全球的流行與傳播[J].肉類工業，2015（2）：49-50.

[11] CHEN X，YANG J X，YU F S，et al.Molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus （PEDV）field strains in south China[J].Virus genes，2012，45（1）：181-185.

[12] HUANG Y W，DICKERMAN A W，PIEYRO P，et al.Origin，evolution，and genotyping of emergent porcine epidemic diarrhea virus strains in the United States[J].mBio，2013，4（5）：1-8.

[13] 楊漢春，周磊.2018年豬病流行情況與2019年流行趨勢及防控對策[J].豬業科學，2019，36（2）：38-40.